实验8化能异养微生物的分离和纯化(综合).docVIP

实验8 化能异养微生物的分离与纯化(综合) [目的要求] 1．掌握细菌、放线菌、酵母苗和霉菌稀释分离、划线分离等技术。 2．学习从样品中分离、纯化出所需菌株。 3．学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。 4．学习平板菌落计数法。 [基本原理] 土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥，偏碱性、有机质丰富的土壤中放线苗数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌；白面曲(发面用的引子)或酒曲或果园土中分离酵母菌。 为了分离和确保获得某种微生物的单苗落，首先要考虑制备不同稀释度的苗悬液。各类菌的稀释度因菌源、采集样品时的季节、气温等条件而异。其次，应考虑各类微生物的不同特性，避免样品中各类微生物的相互干扰。细菌或放线苗在中性或微碱性环境较多．但细菌比放线萌生长快，分离放线菌时，一般在制备土壤稀释液时添加10%酚或在分离培养基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌(如加链霉素25-50μg ml以抑制细菌；添加制霉菌素50μg／ml或多菌灵30μ／ml以抑制霉菌)；酵母苗和霉菌都喜酸性环境，一般酵母菌只能以糖为碳源，不能直接利用淀粉，酵母菌在pH 5时生长极快。而细菌生长适宜的酸碱度为pH7，所以分离酵母菌时只要选择好适宜的培养基和pH，可降低细菌增殖率，霉菌生长慢，也不干扰酵母菌分离。若分离霉菌，需降低细菌增殖率，一般培养基临用前须添加灭过菌的乳酸或链霉素。为了防止菌丝蔓延干扰菌落计数，分离霉菌时常在培养基中加入化学抑制剂。要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。四大类微生物的分离培养基、培养温度、培养时间见表所示。 (材料与用品) 1.菌源 选定采土地点舌。铲去表土层2～3cm，取3～10cm深层土壤10g，装入已灭过菌的牛皮纸袋内．封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌种的变化。从面曲中分离酵母菌。也可用酒曲等替代。 2．培养基 肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基、高氏合成一号培养基、豆芽汁葡萄糖培养基(制平板和斜面， 3．无菌水或无菌生理盐水 配制生理盐水．分装于250ml锥形瓶中，每瓶装99ml(或95ml分离霉菌用)，每瓶内装10粒玻璃珠；分装试管，每管装约4.5—5ml(不超过试管高度的1／5)。 4．其他试剂与用品 无菌培养皿、无菌移液管、无菌玻璃涂棒(刮刀)、称量纸、药匙、洗耳球、10％酚溶液。 [实验步骤] 1．稀释分离法 平板分离菌有倾注法和涂布法两种。本次实验分离细菌、放线菌、霉菌时采用倾注法，酵母菌分离采用涂布法： (1)细菌的分离 1)制备土壤稀释液 称取土样1 g，在火焰旁加入盛有99ml并装有玻璃珠的无菌水或无菌生理盐水锥形瓶中．振荡10一20min，使土样中菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成10—2稀释度的土壤稀释液。然后按10倍稀释法进行稀释分离，以制备10-2稀释度为例，具体操作过程如下：取4.5 ml无菌水试管6支，按10-2……10-7顺序编号，放置在试管架上。取无菌移液管一支，从移液管包装纸套 中间撕口，将包装纸套分成上、下两段，去除卜段包装纸套，在移液管上端管口装橡皮头，取出下段移液管纸套放置桌面，以右手拇指、食指、中指拿住移液管卜端的橡皮头，将吸液端口及移液管外部表面迅速通过火焰2～3次，杀灭撕纸套时可能污染的杂菌，切忌不要用手指去触摸移液管吸液端口及外部。左手持锥形瓶底，以右手掌及小指、无名指夹住锥形瓶上棉塞，在火焰旁拔出棉塞(棉塞夹在于上，不能乱放在桌上)，将1ml移液管的吸液端伸进振荡混匀的锥形瓶土壤悬液底部，用手指轻按橡皮头，在锥形瓶内反复吹吸二次(吹吸时注意第二次液面要高于第一次吹吸的液面)，然后准确吸取0.5ml 10-2土壤稀释液，右手将棉塞插回锥形瓶上，左手放下锥形瓶，换持一支盛有4.5ml无菌水的试管，依前法在火焰旁拔除试管帽(或棉塞)，将0.5m1 10-2土壤稀释液注入4.5m1无菌水试管内，制成l0-3的土壤稀释液，将此移液管通过火焰再插入原来包装移液管的下段纸套内，以备再用。另取一只未用过的无菌移液管在试管内反复吹吸三次，然后取出移液管，并将其通过火焰再插入原来包装移液管的下段纸套内，以备再用。盖上试管帽。右手持10-3稀释液试管在左手十敲打20～30次。混匀土壤稀释液。再从纸套取出原来的移液管，插入稀释液已很匀的试管内，再吹吸三