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探究口腔分泌性白细胞蛋白酶对艾滋病毒的抑制作用 96k2b 骆媛 107230 立题依据： 1.上世纪八九十年代，流行病学分析发现艾滋病通过口腔唾液传播的几率是极低的，或者说基本没有。虽然研究人员可以在艾滋病人的唾液里检测到艾滋病毒的基因，但从那里分离出来的病毒却没办法去感染别的细胞。这个现象引出一个大胆猜想：口腔里一定含有一些抗艾滋病毒的成分！ 2.近期，美国科学家发现，人的唾液中有一种“分泌性白细胞抑制蛋白酶”的蛋白质，这种蛋白在试管中可以有效抑制艾滋病病毒感染人体免疫细胞南京大学校医学院吴稚伟教授ELISA方法检测血清或血浆标本中人类免疫缺陷病毒HIV（1+2）型抗体，预包被高纯度基因重组HIV（1+2）型抗原，可与标本中的抗-HIV抗体反应，加入HRP标记HIV（1+2）型抗体抗原结合，形成抗原－抗体－酶标抗原复合物，然后加入TMB底物产生显色反应。通过酶标仪检测吸光度（OD值），根据OD值判断HIV抗体的存在与否。 3.双抗原夹心法检测抗体 . 4.HIV的特性和感染途径 1）基本结构 2）生活周期：吸附-穿入-脱壳-生物合成-组装成熟和释放 HIV-1通过gp120与靶细胞表面CD4分子和趋化因子受体结合 3）感染后的血清学改变 实验方法： 试剂与器材： 1.微量加样器、洗板机、温箱、冰箱等 2.第四代艾滋病酶联免疫试剂 （solid phase: 病毒裂解液;重组抗原合成肽;HIV-1 / -2 / -O;anti-p24 Ab Conjugate: 病毒裂解液;重组抗原合成肽;HIV-1 / -2 / -O;anti-p24 Ab Specific detection of: IgM / IgG 抗体;HIV-1 / -2 / -O;p24 抗原 Method:夹心） 3. HIV检测试剂盒，包括①HIV酶标板；②HIV酶标试剂；③HIV（1+2）型阳性及阴性对照血清；④显色剂A液和B液；⑤浓缩洗涤液、终止液、自封袋、封板膜等 4.口腔分泌性白细胞蛋白酶抑制 操作步骤： 设实验组和对照组两条酶标版 配液：将50ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释至1000ml备用。 编号：实验组和对照组都将样品对应微孔按序编号，每板设阴性对照2孔、阳性对照3孔，空白对照2孔。 加样：对照组分别在相应孔加入待检标本A、阴性、阳性对照100μl，实验组分别在相应孔加入待检标本B、阴性、阳性对照100μl，用封板膜封板后置37℃温育60min 洗涤：小心把封板膜揭去，用洗板机选择5次程序，洗板后在干净纱布上拍干。 显色：每孔加入底物缓冲液50μl，TMB 50μl，轻轻振荡混匀，封板后置37℃避光显色10min。 测定：每孔加终止液50μl，轻轻振荡混匀。设定酶标仪波长为450nm（建议使用双波长的酶标仪比色，参考波长630 nm），空白调零，读取各孔OD值。 观察结果：比较两组的OD值 预期结果： 实验组的OD值小于对照组的OD值，推测实验组的HIV感染活性受到一定程度的抑制 参考文献： 1.《分泌性白细胞蛋白酶抑制剂研究进展》（潘其重 《河北医药》） 2.《分泌性白细胞蛋白酶抑制因子研究进展》（中科医学网） 3.《HIV检测技术》（湖北省十堰市太和医院检验部 胡秀学） 4.《医学免疫免疫学》（吕昌龙 李一 任欢） 5.《医学免疫学常用实验技术》（吕昌龙 李一 任欢） 6.《HIV测定（ELISA法）标准操作规程》 7.《分泌性白细胞蛋白酶抑制因子对口腔黏膜屏障保护作用的研究》（王智 周红梅）