钙磷降解材料生物矿化细胞分子生物学基础研究.pdf

摘要 生物医用材料是材料科学技术的一个分支，相关研究涉及生物医学领域中 最基本的科学问题。为了探讨无生命的物质参与构建有生命组织的机制，开展 了钙磷降解材料生物矿化的细胞分子生物学基础研究。 设计并建立了细胞培养一基因克隆一基因表达一蛋白质纯化一蛋自 质分子与材料作用的系统研究模式。首先采用酶消化法和植块法从Wistar乳鼠 颅骨体外分离培养了大鼠成骨细胞，两种方法获得的成骨细胞经传代培养和纯 化后，显示出高的碱性磷酸酶活性和钙结节形成能力，具有良好的生物学特性。 将原代培养后传至第3代、经过纯化、状态良好的成骨细胞进行冻存，复苏后存 活率达93％，碱性磷酸酶染色呈强阳性，有钙结节形成，可扩增碱性磷酸酶基因， 与未冻存细胞比较，复苏细胞的生物学特性无明显改变； 设计了一对PCR反应特异性引物Fl、R1，从酶消化法分离培养的Wistar乳 鼠成骨细胞总RNA中扩增出骨粘连蛋白的编码区cDNA序列，将PCR产物插 据库中收录的一致； 将大鼠骨粘连蛋白基因重组到原核表达载体pGEX．KG中，构建了正确的表 达载体pGEX．KG／ON，在大肠杆菌E．coliBL21(DE3)pLysS中实现了全长表达， 表达的融合蛋白存在于细菌裂解液上清中，上清中的目的蛋白采用硫酸铵分级 沉淀、超滤膜分离、GST亲和层析逐步纯化，获得了高纯度的大鼠骨粘连蛋白； 将大鼠成骨细胞与钙磷材料混合培养，显微镜下可观察到成骨细胞对钙磷 材料有明显的吞噬作用：细胞计数、MTT和CKK-8等实验结果表明，钙磷材料 有利于成骨细胞增殖； 将骨粘连蛋白与Ca2+离子作用，采用等离子体发射光谱仪进行检测，证明 所获得的骨粘连蛋白可结合钙离子；骨粘连蛋白与钙磷材料作用后，SEM、XRD、 XPS测试结果显示，蛋白在钙磷材料表面发生了吸附和键合反应。骨粘连蛋白 通过ca2+离子结合位点结合ca“，通过一NH3+结合P04’，并启动羟基磷灰石晶 核形成，以高的亲和力吸附羟基磷灰石晶核后，从材料表面解吸，通过胶原结 合位点在胶原纤维上吸附，实现其结合钙／磷、转运钙／磷、结合胶原蛋白的功能， 引导钙盐在基质中沉积和骨的矿化。 关键词：骨粘连蛋白；基因克隆：基因表达；蛋白质纯化；钙磷材料；生物矿化 ABSTRACT biomedical areaofmaterialsscienceand Researcheson materials，asignificant involvedintheessentialinbiomedicine．Inorderto technology，are topics investigate of mechanismofthebio—transformationmaterialsinto the inorganic biological werecarriedoutrelatedtothemolecularcell tissues，works organic biologicalaspects ofthe mhaeralizationof calcium materialsinthis biological biodegradablephosphate dissertation． research osteoblastisolationandcell Asystemic mode，i．e．from culture，gene of theinteractionofosteonectin osteonectin，to clonin