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项目四：香菇多糖的生产 任务1：香菇多糖制备方案的制定 香菇多糖的概述 香菇多糖（简称LNT），存在于香菇中，分子量为100万，是从香菇中分离纯化的一种葡聚糖，是以增强T细胞和巨噬细胞功能为主的免疫增强剂。与化疗或放疗联用可发挥增效减毒作用。 性质： 外观：白色或棕黄色粉末状固体 稳定性：对光和热稳定 溶解性：能溶于水，水溶液为中性，水中最大溶解度为3mg/ml,溶解度随分子质量增大而降低：带有硫酸根或乙酰基团的香菇多糖，其水溶性大大提高，不溶于甲醇、丙酮、高浓度乙醇等 旋光性：在不同的NaOH溶液中有不同的旋光度 其他：香菇的主要成分是多糖类和不饱和脂肪酸，经热水提取的香菇多糖可调节人休内有免疫功能的T细胞活性，可降低甲基胆蒽诱发肿瘤的能力。 3. 药理作用：具有免疫增强作用，其机制在体内虽无直接杀伤肿瘤细胞作用，但可通过增强机体的免疫功能而发挥抗肿瘤活性。在体内能使脾脏和腹腔的NK细胞活性增强，诱生干扰素与本品剂量相关，其活性与白细胞介素类或干扰素诱导剂有协同作用。另有证明，在体外本品可增强脱氧胸腺嘧啶核苷的抗艾滋病毒的活性。 香菇多糖通过激活巨噬细胞，增强抗体依赖性细胞诱导的细胞毒（ADDC），发挥抗肿瘤活性；此外，香菇多糖还能使肿瘤部位的血管扩张和出血，导致肿瘤出血坏死和完全退化。 4. 生物活性 （1）香菇多糖的抗肿瘤活性 （2）香菇多糖的免疫调节 （3）香菇多糖的抗病毒活性 （4）香菇多糖抗感染作用 二、实训目的 1、掌握水溶醇沉法分离多糖类化合物的原理和方法。 2、掌握香菇多糖的含量测定 三、实训原理 1.在组织中，多糖多与蛋白质以共价相结合，所以在生化产品制备工艺中，往往第一步多用酶降解蛋白质部分或用碱使多糖—蛋白质间的键裂开，以促进多糖在提取时的溶解。碱性提取可避免多糖中硫酸基团水解而破坏。现多采用碱性提取的同时用蛋白质水解酶处理组织。提取液中存在的蛋白质可用普通蛋白质沉淀剂使之沉淀，也可用其他方法使变性沉淀，如适当调pH和加热等。 2.本实验中性多糖常用水作溶剂来提取，可以用水浸煮。 3.香菇中色素较高，活性炭有脱色素、脱去异味等作用。 4.蛋白质不溶于氯仿等有机溶剂，可对香菇多糖进行除去杂蛋白。而香菇多糖在氯仿中溶解度大于在热水中的溶解度，所以可以用氯仿对香菇多糖进行萃取 5.乙醇沉淀法提取多糖时，乙醇的浓度及提取方式对多糖的得率影响较大。最有效的方法是向多糖溶液中加入乙醇，使乙醇的最终浓度依次达到40%、60%、70%、80%，离心每次沉淀，乙醇沉淀得到的不一定是纯的多糖，还需用凝胶柱色谱进行分离纯化。 6.用苯酚—硫酸法显棕色，可以对多糖进行定性检测。 7.香菇子实体有含量较多的脂类的物质，可以用石油醚、乙醚等低级性溶剂除去脂溶性杂质。 8.因为香菇肉质太厚，萃取时氯仿很难渗透至其深处，则萃取物的产率低。热水提取法多糖在260nm和280nm波长处有较明显的吸收峰 四、实训材料、仪器与试剂 1.器材：组织捣碎机、恒温水浴锅、循环水式真空泵、冷冻离心机、凝胶柱、脱脂棉、再字夹、紫外分光光度计、容量瓶、试管、烧杯、紫外检测仪、记录仪、流量泵 2.试剂：氯仿、无水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚-硫酸试剂：苯酚3g,浓硫酸5mL，溶于95mL无水乙醇中。 3.原料:香菇 五、实训步骤 （一）多糖的提取 1.热水浸提：称取香菇10g,于组织捣碎机内粉碎，倒入 烧杯中，加20倍量的水，将烧杯放入恒温水浴锅中90℃）加热30min,然后用布氏漏斗和真空泵进行抽滤，取滤液。 脱色，除味：在滤液中加入活性炭（1mg/ml），搅 拌吸附1h，抽滤，取滤液。3.萃取、除杂蛋白：在滤液中加入氯仿溶液，充 分混合后，过滤，取滤液。重复萃取、除杂3次。 乙醇沉淀：在萃取液中加入无水乙醇， 使其乙醇浓度达80%，沉淀12h,于冷冻离心机（ 4000r/min）离心30min，取沉淀 脱脂：沉淀物分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤3次，即得香菇多糖提取物。 （二）多糖纯化 取上述香菇多糖提取物溶于蒸馏水中，离心除去不溶物。 SephadexG100凝胶装好柱，用蒸馏水平衡48h , 然后将上清液上柱分离，用蒸馏水洗脱，洗脱速度5ml/20min（可用恒流泵控制洗脱速度）,200nm波长紫外检测，收集主要峰部分（当记录仪上出现波峰时即用试管开始收集洗脱液），冷冻干燥得白色香菇多糖，并称重。（三）香菇多糖分析检测 1．定性检测—苯酚-硫酸法 将苯酚-硫酸试剂喷洒在冷冻干燥好的白 色香菇多糖上110℃，加热香菇多糖几分钟，显棕色即为多糖。 2.定量检测---分光光度法 a.标准曲线的制备 精密称取(可用分析天平）60℃干燥至恒重的甘