实验 叶绿体分离离体叶绿体的还原活性.doc

实验五 叶绿体的分离、离体叶绿体的还原活性 一、实验目的 制备具有活性的离体叶绿体和测定希尔反应活力是研究叶绿体结构功能和光合作用机理的重要技术条件。本实验通过学习分离制备叶绿体的技术方法，加深对希尔反应的理解及对光反应的认识。 PSⅡ和PSⅠ经过两种连续光化学反应驱动的，PSⅡ的一个重要功能是利用光能使水裂解放氧。 2H2O 光子 O2 + 4H+ + 4e- 英国生物化学家Hill（1937）首先将离体叶绿体加入有适当氢受体（如草酸高铁钾盐，2,6-二氯酚靛酚，NAD+和NADP+）的水溶液中，照光后即有O2放出，这就是水的光解，即希尔反应。 叶绿体的分离采用离心分级分离，即利用叶绿体的直径和沉降系数与其他细胞器不同的特点，先用低速离心除去细胞碎片，后用高速离心沉降叶绿体。希尔反应活力的测定是将叶绿体加入，并照光，水被光解放氧测定。 新鲜菠菜叶片。 四、设备与试剂 分光光度计，离心机，照光装置（2 只500W 钨灯作为光源），试管，移液管，烧杯，纱布，研钵等。 0.35MNaCl溶液、0.01MTris溶液 五、实验步骤 1、离体叶绿体的制备： 1ml Tris缓冲液、石英砂，研磨。 匀浆用脱脂棉过滤。 1000转/分离心5分钟，取上清液，3000转/分离心5分钟。 去除上清液，保留沉淀。 在沉淀中加入5ml 0.35M NaCl，搅匀，得到叶绿体悬浮液。 2、希尔反应活力的测定 然后将比色杯置于光源60cm处照光。 每隔1分钟快速读下光密度的变化，连续进行5~6次读数。 表1 管号 0.1mlTris缓冲液 叶绿体 煮沸 2.6-二氯吲哚叮酚 1 9.3ml 0.2ml —— 0.5ml 2 9.3ml 0.2ml 5min 0.5ml 3 9.8ml 0.2ml —— —— 六、实验结果 表2 管号 光值1 光值2 光值3 光值4 光值5 1 2 3 将所测光值记录到上表，画出曲线图，并分析原因。 七、注意事项 1、 2.6-二氯吲哚叮酚 必须在煮沸加热后滴加。 2、溶液加入比色杯就开始计时。 3、每次测光时都应调零和百分比。 4、试管加热时管口不要对准他人。 八、思考题 1. 试管中蓝色褪去的原因是什么? 与光照有什么关系?2．煮沸对叶绿体有何影响？3．请对结果作出解释。 附录1：离心机的构造及使用 离心机是利用离心力对混合液（含有固形物）进行分离和沉淀的一种专用仪器。实验室常用电动低速离心机、高速离心机和低速、高速冷冻离心机，以及超速分析、制备两用冷冻离心机等多种型号。其中以低速（包括大容量）离心机和高速冷冻离心机应用最为广泛，是生化实验室用来分离制备生物大分子必不可少的重要工具。 在实验过程中，欲使沉淀与母液分开，常使用过滤和离心两种方法。?在下述情况下，使用离心方法效果较好。? 沉淀有粘性或母液粘稠。? 沉淀颗粒小，容易透过滤纸。? 沉淀量过多而疏松。? 沉淀量很少，需要定量测定。或母液量很少，分离时应减少损失。? 沉淀和母液必须迅速分开。? 一般胶体溶液。电动低速离心机的基本结构和性能? 低速离心机结构较简单，可分小型台式和落地式两类，配有驱动电机、调速器、定时器等装置，操作方便。低速离心机其转速一般不超过4000rpm，台式高速离心机最大转速可达18000rpm。? 离心机的一般使用规程?? 1、离心前，先将离心的物质转移入合适的离心管中，其量以距离管口1~2cm为宜，以免在离心时甩出。将离心管放入外套管中，在外套管与离心管间注入缓冲水，使离心管不易破损。? 2、取一对外套管（内已有离心管）放在台秤上平衡。如不平衡，可调整缓冲用水或离心物质的量。将平衡好的套管放在离心机十字转头的对称位置上。把不用的套管取出，并盖好离心机盖。? 3、接通电源，开启开关。? 4、待离心机自行停止转动手，打开机盖，取出离心样品。? 5、将外套管、橡胶垫冲洗干净，倒置干燥备用。 注意事项? 1、低速离心机要放在平坦和结实的地面或实验台上，不允许倾斜。 2、一年检查一次电动机的电刷及轴承磨损情况，必要时更换电刷或轴承。 3、关闭电源后，要等候离心机自动停止。不允许用手或其他物件迫使离心机停转。4、离心机应接地线，以确保安全。?5、离心机启动后，如有不正常的噪音及振动时，可能离心管破碎或相对位置上的两管重量不平衡，应立即关机处理。? 附录2：721型分光光度计的原理及使用方法 1.吸收光谱原理 物质中分子内部的运动可分为电子的运动、分子内原子的振动和分子自身的转动，因此具有电子能级、振动能级和转动能级。 当分子被光照射时，将吸收能量引起能级跃迁，即从基态能级跃迁到激发态能级。而三种能级跃迁所需能量是不同的，需用不同波长的电磁