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实验四 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳 EcoR I Restriction Enzyme 识别序列 ------G↓AATT C ------ ------ C TTAA↓G ------ BamH I Restriction Enzyme 识别序列： ------ G↓GATC C ------ ------ C CTAG↓G ------ 每一种限制性内切酶都有特定的反应条件： pH范围： 7.5~8.0 缓冲液组份: Tris(三羟甲基氨基甲烷）、 NaCl、 MgCl2、 温育温度：37℃ 反应体系： DNA (1ug或更少) 5ul 10 x Buffer 2ul Restriction Enzyme 3ul H2O 10ul Total 20ul 混匀，37度保温30分钟 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。 琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围 电泳法的优点 凡是能带电的物质，都可以用电泳法分离。 样品用量少。 设备简单。 可在室温进行。 操作简便，费时不多 不同类型的电泳，有不同的用途。 改进或找到更好的支持介质，就有可能大大地提高分辩率。 1、TAE电泳缓冲液 Tris-base 冰醋酸 EDTA 2、琼脂糖凝胶（0.8%） 琼脂糖：0.8g TAE：100ml 3、溴化乙锭(ethidium bromide，EB) EB染色液工作液浓度：0.01~0.03mg/ml EB是一种荧光染料，其扁平分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。 4、6 x Loading Dye 组成 0.25% bromophenol blue（深蓝色） 0.4% orange G （黄色） 10mol/L Tirs-HCl (pH7.5), 50mol/L EDTA 使用量 5份DNA样品溶液加1份Blue / 6xLoading Dye 操 作 步 骤 一、酶切反应 反应体系： λ－DNA 5ul 10 x Buffer 2ul Hind III 3ul H2O 10ul Total 20ul 混匀，37度保温30分钟 二、电泳 3、点样和电泳 λ-DNA / Hind III Markers片段大小（ bp）和电泳带型示意图 警告 胶染色和观察时一定要带手套！！！ 结果记录与分析 绘制电泳图谱 * * 实验原理---限制性内切酶及酶切反应 Hind III Restriction Enzyme 识别序列： ------ A↓AGCT T ------ ------ T TCGA↓A ------ 实验原理---琼脂糖凝胶电泳 电泳是在一个电场的作用下，在琼脂糖支持介质上，能将一个混合物分离成若干条区带（若干个组分）的过程。 琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。 琼脂糖 0.1～2 12.0 0.2～3 1.5 0.9～6 1.2 0.5～7 0.9 0.8～10 0.8 1～20 0.6 5～60 0.3 线型DNA分子的分离范围(Kb) 琼脂糖浓度(%) 试剂 。 1、电泳前的准备工作 轻轻刷干净电泳制胶的梳子，模板，电泳槽，用蒸馏水洗净晾干，把制胶槽放入模板中。 2、制 胶 (1)每组称取琼脂糖0.24g,倒入三角瓶，再往其中