聚乙二醇化药物研发中修饰剂的选择与质量控制.pdfVIP

聚乙二醇化药物研发中修饰剂的选择与质量控制    前言  20世纪80年代初，以干扰素、人生长激素为代表的一大批通过重组DNA技术开 发的蛋白质药品陆续上市，给人类的一些难治疾病提供了有效的治疗手段。经过近 30年的发展，蛋白质药物已成为全球医药市场上最重要的药物种类之一。蛋白质类 药物（以下简称为蛋白质药物）是指干扰素、人胰岛素、促红细胞生成素（EPO）、 白介素和人生长激素等生物工程药物。然而，蛋白质药物作为异源蛋白，属于天然 抗原，注射到人体内后，会受到各种蛋白酶的攻击而失去生物活性，并且可能引发 抗体的产生，通过抗体抗原反应而被消除，严重的甚至会引起过敏反应。蛋白质药 物另一显而易见的缺点是，它们在人体内的半衰期太短，有时一天需要注射3~4次。  基于以上特点，蛋白质药物在临床上常用的剂型为注射用溶液剂和冻干粉针剂， 给药途径单一，且必须频繁给药，患者的依从性差。因此，研制开发蛋白质药物的 给药技术，增加蛋白质药物的稳定性、膜透过性，延长其半衰期，使其更好地应用 于疾病的预防和治疗，已成为现代药剂学的热点。蛋白质药物的聚乙二醇化，不仅 能够有效防止蛋白质药物在体内的很快降解，还能将药物缓慢释放并靶向送达体内 的作用部位，从而达到长效缓释靶向目的。蛋白质药物进行聚乙二醇修饰（聚乙二 醇化，pegylation）之后，空间结构发生改变。聚乙二醇具有空间位阻，将蛋白质 表面的抗原决定簇掩盖起来，使蛋白质分子不能与各种细胞表面受体结合，不被机 体的免疫系统识别，避免了相应抗体的产生，抑制相应的免疫反应，即化学修饰解 除异体蛋白免疫原性的基本原理。同时，修饰剂的屏障效应，使蛋白质不易受到各 种蛋白酶的攻击，降解速率明显降低，有利于药用蛋白活性的发挥。另外，蛋白质 化学修饰之后，修饰剂与蛋白质分子偶联，使得蛋白质的分子量增大，空间结构发 生改变。当修饰后的蛋白质分子量达到或超出肾小球滤过作用的阈值时，蛋白质随 血液循环进入肾脏后就可以逃避肾小球滤过作用，因而可以在血液循环中停留更长 的时间。  修饰剂的选择与质量控制  虽然通过聚乙二醇对蛋白质药物进行修饰可以获得种种优点，但是蛋白质药物 修饰是一个复杂的过程，很多因素对蛋白质的化学修饰反应会造成较大的影响。在 对蛋白质进行聚乙二醇修饰时还应注意以下问题：①修饰剂的水解稳定性和反应活 性；②蛋白质的修饰位点，修饰剂与蛋白质上的残基之间的反应类型和专一性；③ 要求的修饰度；④修饰剂与蛋白质的连接键的稳定性、毒性、抗原性；⑤修饰后是 否易于分离、纯化；⑥是否适于建立快速、方便的分析方法；⑦修饰剂是否能够简 便经济地合成或购买。   1、聚乙二醇修饰剂类型的选择   • 聚乙二醇修饰剂的活性基团  聚乙二醇修饰剂的类型种类繁多，根据蛋白质上被修饰基团不同，需要使用不 同的聚乙二醇修饰。首先是蛋白质修饰位点的选择，先考虑单一位点修饰；如果待 修饰物的序列和结构特征决定其不能避免有多个潜在修饰位点，应考虑选择修饰反 应可控的位点，如通过反应条件的控制能够进行明确位点的选择性修饰。其次，考 虑修饰之后是否会导致蛋白质结构的改变情况，例如是否会产生新的抗原表位，是 否会影响蛋白质的关键活性区域等。最后，根据修饰位点的基团选择相应的聚乙二 醇修饰剂。  第一代聚乙二醇化随机修饰蛋白质，多以赖氨酸的ε‐NH2为修饰目标。由于赖氨 酸在蛋白质内通常数量较多，难以控制药物和PEG偶联的部位及偶联的聚乙二醇的 数目。这种随机修饰方式，常会导致药物活性降低甚至丧失。位置选择性的聚乙二 醇化能够对基团进行选择性的修饰，避免或减少对活性位点的损失，并且能较好地 控制修饰程度，有利于产品质控和工业化生产。常见的有以下两种方法：  一、利用蛋白质N‐末端氨基的高反应活性。在低pH值（如pH=5.0）溶液中，端 基为醛基的聚乙二醇与N‐末端氨基反应的机率远远大于与赖氨酸上的ε‐NH2 ，聚乙二 醇主要与蛋白质N‐末端氨基相连。有研究者采用聚乙二醇‐丙醛修饰表皮生长因子 （EGF），与随机修饰的产物相比，两者半衰期都延长了4～6 倍，但定向修饰的产 物基本保持原活性，而随机修饰则造成活性几乎完全丧失。  二、利用巯基的高反应活性，选取能够特异性与巯基偶联的聚乙二醇偶联剂， 可以定向修饰蛋白质。由于蛋白质药物中含巯基的半胱氨酸的残基比赖氨酸要少得 多，所以半胱氨酸是一个理想的选择性修饰位置，而且半胱氨酸可以通过基因工程 准确加入到多肽药物预先设计的位置。这种位置选择性修饰需要利用几种具有巯基 反应活性的聚乙二醇