高效液相色谱法介绍.pptVIP

高效液相色谱 色谱法的分类 液相色谱分析是在经典的液体柱色谱基础上，引入了气相色谱的理论；在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化，这种柱色谱技术被称做高效液相色谱法。 第一节 高效液相色谱绪论 一、色谱法的历史与展望 一、历史： 30年代 茨维特分离绿叶色素(Tswett实验) 40年代 TLC，纸色谱 50年代 GC出现使色谱具备分离和在线分析功能 60年代末 HPLC出现，使色谱分析范围进一步扩大 二、展望： 1．新型固定相和检测器 2．联用仪器：GC-MS，HPLC-MS 3．智能化发展 色谱法溯源 茨维特的实验（图示） 色谱三要素： 固定相； 流动相； 待分离物质。 经典液相色谱法 二、什么是HPLC 气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。所以，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱。 第二节 高效液相色谱的特点与仪器 一、高效液相色谱法的特点 二、流程及主要部件 三、高效液相色谱仪 一、高效液相色谱法的特点 HPLC与经典LC区别 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段 1．经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径1~3cm，固定相粒径100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测 2．HPLC：分离和分析 柱内径2~6mm，固定相粒径10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测 HPLC与GC差别 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别 1.分析对象： 　GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测，占有机物的20% 　HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制，分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测，用途广泛，占有机物的80%。 2.操作条件： 　GC：加温操作 　HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 3.流动相 GC: 惰性气体，分离主要取决于组分分子与固定相之间的作用力 HPLC:流动相与固定相之间有一定的亲和力，分离过程的实现是组分、流动相和固定相三者之间相互作用的结果，分离不但取决于组分和固定相的性质，还与流动相的性质密切相关。 1.流程 1.流　程 典型的仪器配置 2.HPLC的主要部件 1.泵 2.梯度淋洗装置 3.进样装置 4.色谱柱 5.检测器 6.数据处理 Aglient1100 HPLC 结构图 2.主要部件 高压输液泵 单活塞往复泵 隔膜型往复泵 双活塞往复泵 梯度淋洗装置 高压梯度 低压梯度 进样装置 六通阀进样器 正确进样方式 自动进样器 （1）高压输液泵 单活塞往复泵 隔膜型单活塞往复泵 双活塞往复泵 单活塞往复泵结构示意（动画） (2)梯度淋洗装置 六通阀进样器 正确的手动进样方式 手动进样器 自动进样器 (4) 高效分离柱 各种色谱柱 色谱柱结构示意图 检测器的种类 (5) 液相色谱检测器 紫外－可见光检测器 蒸发光散射检测器 紫外-可见光检测器 基于样品池(S)中的样品对光产生吸收，有信号差 蒸发光散射检测器原理 色谱工作站登录界面 HPLC图形结果 第二节　色谱定性定量的方法 一、定性 二、定量 一、用保留时间定性 保留时间相同，可能是同一组分； 保留时间不同，肯定不是同一组分。 外标法定量 配制一系列已知浓度的标样 外标法定量（二） 实际色谱图 外标法定量（三） 计算公式 特点 无需各组份都被检出、洗脱 需要标样 标样及样品测定的条件要一致 进样体积要准确 峰面积百分比法定量 公式： 特点： 各组分要全部流出、全部被检测，并对检测器的响应值一样简单，液相色谱目前很难做到这点 与进样量无关 不需标样 简单 液相色谱的应用（1） 液相色谱的应用（2） 外标法 在液相色谱中用的最多 内标法 准确，但是麻烦 在标准方法中用的最多 峰面积百分比法 由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用 二、常用的定量方法 线性要求 标准曲线法 液相色谱法定量常用术语 标准曲线 Back Back （见液相色谱真机演示） 注意两个单相阀的运动和作用 (2)