4dna--重组-酶切和连接.pptVIP

QA 关于质粒提取结果的分析 QA 关于实验中的安全问题 关于酚-氯仿-异戊醇分层问题：下层作用问题：酚变性蛋白 氯仿去除脂类，除酚 异戊醇消泡，减少表面张力剪切 关于酚：下层； 氧化判断 基因重组－酶切和连接 每100uL溶液加入500uL溶胶液,混匀。 将液体转移至吸附柱，12000rpm离心30秒，去除废液 漂洗:向吸附柱的正中央加入500uL漂洗液，12000rpm离心30秒，去除废液。重复一次。 空柱12000rpm离心2min，以彻底去除废液 将吸附柱置于一新的干净无菌的1.5mLEP管中，向吸附柱的正中央加15uL无菌水，室温放置5分钟。12000rpm离心30秒，以洗脱DNA。 再次向柱子的正中央加5uL无菌水，室温放置5分钟；12000rpm离心2分钟。合并回收液。 SYBR检测回收产物 * 预实验结果 载体 （3.65kb） 1 2 3 PET Blue质粒DNA的琼脂糖电泳（1%） Lane1：sample 1 Lane2：sample 2 Lane3：sample 3 一条带 杂带 预实验结果 PET Blue质粒DNA的琼脂糖电泳（1%） Lane1：sample 1 Lane2：sample 2 Lane3：sample 3 两条带 三条带 DNA分子的大小 琼脂糖浓度 DNA分子构象 染色剂的量 电压 缓冲液的组成 缓冲液离子强度 等等…… 分子克隆上册,第五章 一条带 1 2 3 我们的结果 PET Blue质粒DNA的琼脂糖电泳（1%） Lane1：Marker； Lane2：sample 1; Lane3：sample 2; Lane4：sample 3 1 2 15000bp 10000bp 7500bp 5000bp 2500bp 1000bp 250bp 3 4 我们的结果 质优量少，成功率低 质优量足 卫星菌落？？ 我们的结果 ???电泳行为异常??? 我们的结果 可用 电泳：尽量减少上样时间，减少扩散； 样品尽量均匀分布于胶孔中； 尽量远离边缘泳道 基因的克隆与表达专题之三 剪切 5’NNGOH pGATCCNN3’ 3’NNCCTAGp HOGNN5’ BamHⅠ HindⅢ + 引物1 5’GTCGCGGATCCGATGTCACGGCCGAGAC 3’ CDS 5’AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT… …………………………………………………………………………. …… ………………………………… AKP CDS …………………………………. ………………………………………………………………………………. ………………………………………………………………………………. CDS ….CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3’ 引物2 3’GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG 5’ BamH1 HindⅢ pETBlue-2 ATG GCG ATA TCC CGG GAG CTC GTG GAT CCG AAT 引物1： 5’GTCGCGGATCCGATGTCACGGCCGAGAC3’ BamHⅠ 引物2： 5’GCGACAAGCTTTATTTCAGCCCCAGAGC3’ HindⅢ 5’pApCpGoH pApApTpTpCpGpT3’ 3’TpGpCpTpTpApAp oHG pCpAp5’ 5’pApCpGpApApTpTpCpGpT3’ 3’TpGpCpTpTpApApGpCpAp5’ Mg2+ ATP T4DNA连接酶 连接 pETBlue-2 3.653kb 酶 切 连 接 酶 切 pETBlue - AKP (5.2kb) pETBlue-2 3.653kb 转化 复苏 pETBlue-AKP －AKP pETBlue-pETBlue AKP √ 酶切：370C，水浴酶切3小时(封口膜封口） 酶切产物的纯化和盒回收： 直接进行液体回收： 每1