生化实验一.pptVIP

普通离心机 高速冷冻离心机 超速离心机 离心机可将悬浮液中的固体颗粒与液体分开；或将乳浊液中密度不同，互不相溶的液体分开(例如从牛奶中分离出奶油)；也可用于排除湿固体中的液体，例如用洗衣机甩干湿衣服；超速管式分离机可分离不同密度的气体混合物；有的离心机还可对固体颗粒按进行密度分级。 ①s=v/ω2r。 s（sedimentation coefficient）是沉降系数，ω是离心转子的角速度（弧度/秒），r是到旋转中心的距离，v是沉降速度。 ②RCF = 1.119 × 10-5 ×(rpm)2 × r RCF表示相对离心场，以重力加速度g的倍数来表示；rpm(或r/min)表示离心机每分钟的转数。 r 表示离心机转轴中心与离心管中心的距离，单位为cm。 * 实验基本要求 实验安排： 实验一 酪蛋白的粗提取 实验二 凝胶层析分离纯化酪蛋白 实验三 酪蛋白含量测定 实验四 SDS测定酪蛋白分子量 实验五 核酸的提取 实验六 谷丙转氨酶活性的测定 实验七 蔗糖酶米氏常数的测定 实验要求： ①准时进行实验，不得迟到、早退。 ②实验前5分钟核对实验用品并登记补齐。 ③课代表实验前10分钟打开柜门、电阀。 ④了解实验安全设施（水冲洗，灭火器）。 ⑤穿实验服，安静，不做无关事。 ⑥按学号两人一组，对面两组同学共用一套试剂，不得取用别组试剂。 ⑦实验结束后上交实验数据，核对实验用品，整理台面。课代表安排4-6名值日生，试剂归位，打扫卫生，关电阀和门窗。 ⑧实验报告的格式：摘要、实验目的、实验原理、实验结果、分析讨论与习题。报告以英文书写为主。 ⑨做好实验预习 蛋白质维持水溶液的胶体状态的因素： ①水化层 ②同种电荷 实验一 酪蛋白的粗提取 一、实验原理 蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀(precipitation)。 1.沉淀方法 ①盐析法②有机溶剂沉淀法 ③重金属盐沉淀法 ④生物碱试剂以及某些酸类沉淀法 ⑤加热凝固法 ①盐析(salting out ) 不变性可逆 低盐浓度 盐溶 同种电荷排斥 高盐浓度 盐析 破坏水化层，中和 (NH4)2SO4、NaCl、Na2SO4 ②有机溶剂 有时变性 失去水化层 等电点更易沉淀 乙醇、丙酮、甲醇、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈、2-甲基-2,4戊二醇等。 1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质或其它溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀； 2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易； 3）在生化制备中应用比盐析法广泛。但是，在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此。因此，操作要求在低温下进行。 ③加热 变性 等电点易沉淀 偏酸、偏碱变性但不易沉淀 加热首先是加热使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清都凝固。 ④重金属盐沉淀 pHpI 时带负电荷 与Cu2+ 、Ag+ 、Hg2+ 、Pb2+ 沉淀 临床上利用这种方法，抢救误服重金属盐中毒的病人，给病人口服大量蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。 生物碱（alkaloid）是存在于自然界（主要为植物，但有的也存在于动物）中的一类含氮的碱性有机化合物。 ⑤生物碱试剂沉淀 能沉淀生物碱的化学试剂叫做生物碱试剂。如：单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸。 吡啶类：如苦参碱 莨菪烷类：如莨菪碱 异喹啉类：如罂粟碱、汉防己甲素、小檗碱、吗啡 吲哚类：如吴茱萸碱、长春碱、长春新碱 萜类：如乌头碱、紫杉醇 甾体：如贝母碱 有机胺类：如麻黄碱、伪麻黄碱 pHpI 时带正电荷 蛋白质与苦味酸、磷钨酸、磷钼酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基水杨酸沉淀 临床血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。 ①变性的蛋白质不一定沉淀 如煮沸的牛奶，其中的酪蛋白已经变性，但并不沉淀。变性的蛋白更容易消化。 2.沉淀与变性的关系 ②沉淀的蛋白质不一定变性 如盐析、低温下有机溶剂沉淀的蛋白质。 ③凝固的蛋白质既沉淀又变性 如酸牛奶的pH已接近有关蛋白质的pI，一旦煮沸便蛋白质开始变性，蛋白质即结絮沉降下来。 牛奶中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质。酪蛋白沉淀后剩余的蛋白质统称乳清蛋白。乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水合能力强、分散性高，在奶中呈高分子状态。 3.酪蛋白（casein）， 又称干酪素、酪素、酪朊，乳酪素 ①来源： 通常是指由