分子生物学实验诊断技术(论文资料).pdfVIP

中国试剂网 3.9.148 分子生物学实验诊断技术 一、酸杂交技术 检验方法建立的基本要素是特异性和灵敏度，在复杂的物体中，使无法感觉的特 定物质进入人类的观察范围。核酸杂交检测技术就是利用核酸碱基严格配对的特 异性，核酸标记物的灵敏度而建立的检测核酸结构与功能的方法。该法建立以来 已有二十年，目前研究实验室用得多，临床实验室用得较少，除成本高外，关键 是操作复杂，重复性差，仅能半定量。成本高可随经济发展而缓和，但其它缺点 尚需努力克服。 杂交实验的探针应具有特异性，对应不同的杂交方法靶基因（被检基因）应有一 定的纯度与丰度。杂交反应的开始是碰撞，探针浓度高则速率增加，一般 32P 标记探记探针5-100ng/ml，非放射性探针25-1000ng/ml ，原位杂交无论放射还是 非放射物标记，一般都需0.1-5.0 μg/ml 。当探针过量时，杂交速率取决于探针长 度，如一个100ng/ml20 个核苷酸的合成寡核苷酸探针与1-100pg 1kb 长的靶基因 杂交，10 分钟能达到最大杂交率。而相同条件下2kb 的克隆探针需160 小时。 主要原因是这里所指浓度是重量浓度而非摩尔浓度。长探针因标记量大，小的摩 尔浓度已足以达到需要的检测灵敏度。为了促进长探针 （＞250 个核苷酸）的杂 交速率，加入杂交促进剂是非常必要的。最常用的是硫酸葡聚糖，使用浓度为5 ％-10 ％，浓度过高会增加杂交液粘度。聚乙二醇也作为促进剂，价廉且粘度低， 但检测本底太高。另外杂交的温度、盐浓度、甲酰胺浓度可调节杂交分子形成的 稳定性。理论选用DNA ：DNA 杂交温度T ＝Tm －25 ℃，此时杂交分子最易形成。 但具体实验中影响Tm 值的因素很多，一般杂交温度低，形成的杂交分子较稳定。 RNA ：DNA 杂交分子的Tm 大 10-15℃，RNA ：RNA 杂交分子的Tm 大20-25 ℃，使得杂交温度提高，此时需调节甲酰胺浓度来调节杂交温度。好的实验条件 最终应在实践中摸索建立。 （一） 点杂交 用探针进行杂交。尼龙膜，特别是聚偏氟乙烯膜 （PVDF ）与DNA 结合力更高， 坚韧、易操作。点样可手工，也可用真空点样品。检测可用放射性探针自显影或 非放射性探针显色。可用于DNA 或RNA 分析。下面以非放射性探针分析DNA 为例，结果是显色。 中国试剂网 3.9.147 取硝酸纤维素膜和滤纸在2xSSC(NaCl 300mmol/L，柠檬酸钠30mmol/L)，pH7.0 浸 15 分钟，平铺滤纸在点样抽滤器上，再铺上硝酸纤维滤膜，真空抽气使点样 器减压，膜显出凹面。点样50 μl （5-10 μgDNA，可直接点血清样品）于凹面， 撤去真空，把膜晾干。取滤纸浸0.5mol/L NaOH，1.0mol/L NaCl，把膜平铺于滤 纸上20 分钟，变性。取滤纸二张分别浸在0.5mol/L Tris-Hcl pH7.5 和 1.0mol/L Tris-HCl，0.6mol/L NaCl pH7.5，分别依次把膜平铺于滤纸上，各中和15 分钟， 中和后膜的pH 为7.2-7.5 。于80℃，30-45 分钟烘干。（RNA 分析点样缓冲液系 统不同，无需变性，中和，余大致相同）用塑料封口机把膜和2.5ml 预杂交缓冲 液封入塑料袋中，42 ℃，水浴30 分钟。 探针2ml （50-100ng/2ml 预杂交缓冲液）于100℃，10 分钟，马上置冰浴5 分钟 （变性）。加入袋封口。42 ℃水浴过夜。去杂交液 （可回收）。以 2xSSC ，0.1 ％ SDS15ml，50℃5 分钟洗二次。0.1SSC，0.1 ％SDS 洗二次。封闭：另取袋封入膜 和封闭液（蛋白质50mg/ml，100mmol/L Tris-HCl(pH7.5)/150mmol/L NaCl）2.5ml ， 37℃