利用TALEN技术向人诱导多能干细胞引入癫痫相关SCN1A基因突变.pdf

摘要 l㈣㈣ 婴幼儿严重肌阵挛性癫痫(SMEI)也被称作Dravet氏综合征，是～种难以治疗 的癫痫病。婴幼儿严重肌阵挛性癫痫有许多复杂的病症，如：严重的难治性癫痫 症状，伴随发病的共济失调和认知障碍。并且婴幼儿严重肌阵挛性癫痫对典型的 抗癫痫痉挛的药物治疗都有抵抗作用。多年的研究证明，这种癫痫的遗传病因是 钠通道的突变。而且由SCNlA基因编码的电压门控型钠离子通道的毡亚基是最 常见的突变发生位点。已经在婴幼儿严重肌阵挛性癫痫病人发现了不同类型的 SCNlA基因突变包括：无义突变，移码突变，错义突变，这些突变发生在SCNlA 基因的不同位置。一些研究团队提出这样的假设：癫痫病症的严重程度是由突变 发生在SCNlA基因上的位置决定的。然而，至今癫痫的疾病表型与基因型之间 的联系仍然不确定。一些关于癫痫的发病机理的研究表明：引起婴幼儿严重肌阵 挛性癫痫(SMEI)的基因突变会导致突变钠离子通道功能的丧失，表现为内向钠电 流显著地减小甚至电流的完全消失。基于以上实验提出假设：这种减小的钠电流 会造成神经系统的超兴奋和导致癫痫相关的痉挛。并且在动物模型上的研究结果 也与这个假设相符并一致表明那些引起钠通道功能丧失的突变都会严重损伤氨 基丁酸(GABA)能抑制性中间神经元的钠电流，从而导致了婴幼儿严重肌阵挛性 癫痫(SMEI)的超兴奋。关于婴幼儿严重肌阵挛性癫痫(SMEI)的分子致病机理仍 需要进一步的研究。 吖叱EN是基因工程中一个重要的高效的工具，它可以在活细胞的基因组的特 异的基因序列上切出缺口。TALEN主要是由两部分组成的。一部分是转录激活 效应器(n址)，它是一种黄单胞菌属的植物病原细菌的毒力因子。这种转录激活 效应器(TAL)的原始功能就是在通过细菌III型分泌系统侵染进入宿主细胞后破 坏宿主细胞原有的基因调控系统并且与效应器特异性识别的基因组序列结合。 吖正EN的另～部分是FoH核酸酶，它可以有效地切割识别的DNA序列，由于 可以在体内特异性地创造出双链的DNA断裂缺口(DSBs)，从而被用于基因操作。 由于FokI核酸酶只有在二聚体的状态下才能切割DNA，所以这些吖山效应器 的核酸酶(n乜ENs)在切割DNA缺口时也是成对发生作用的。然而这些在细胞 里的双链缺口(DSBS)可以通过细胞自身的非同源性末端接合烈HEJ)进行修复， 利用n也EN技术建立向人诱导多能干细胞敲入癫痫相关Navl．Ia亚基A5768G突变细胞i塞型 但非同源性末端接合(NHEJ)会损伤打靶基因导入小片段的插入和缺失。这些双 链缺口(DSBs)也可以通过同源重组(HR)进行修复，但这需要一个同源的DNA片 段作为模版去复制跨过缺口的信息，这种修复可以被用作基因的插入和替换。 到目前为止，科学家在研究神经退行性疾病上遇到了许多困难。人诱导多能干 细胞衄PSC)技术可以将人体细胞人工地重编程到一种多能性的状态，然后可以 将这些多能性的细胞分化成几乎任何类型的与疾病相关的细胞、组织，所以它为 体外神经疾病的建模提供了几乎无限的疾病相关的、病人特异性的成体细胞。同 时人诱导多能干细胞咖PSC)技术可以避开与胚胎干细胞(ES)相关的伦理道德问 题以及潜在的同种异体的免疫排斥问题。总之，与疾病相关的基因修复的病人特 异性诱导多能干细胞的获得是生物医学研究和药物开发领域的一个重大进展。 通常，我们会拿病人来源的疾病相关的细胞系和一株正常人的细胞系作比较， 然而这种比较存在很大的缺陷。一方面，神经退行性疾病在体内通常都有一个较 长的潜伏期和一个缓慢的细胞病变过程，而且大部分都是晚年才发病的。更重要 的是，在体外这些疾病的表型都很微弱。另一方面，这两株细胞系不同的基因背 景也为体外研究增加了一个很大的阻碍，因为任何我们观察到的这两株细胞系的 区别都不能被定义成到底是疾病相关的损伤还是因为不同的遗传背景。所以，要 从不可预知的遗传背景变化中区别这些微弱的但是与疾病相关的表型变化是很 困难的，这需要更严格的使遗传背景相匹配的研究方法。 因此，为了建立一个遗传背景确定的实验系统去研究癫痫的治病机理，我们做 的工作主要包括： 1、 获得了一株正常人来源的诱导多能干细胞株(iPSCs)，这株诱导多能干 细胞株是由皮肤成纤维细胞重编程获得的并且拥有正常的基因型。然后 我们设计了打靶SCNlA基因的n地EN，并且对这株干细胞的内源性 变了正常人来源的诱导多能干细胞的SCNlA基因，引入了点