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第四章 DNA分子克隆 基因克隆方案 重组子的筛选 第一节 重组体导入受体细胞P109 接合转化 噬菌体转染 噬菌体转导 CaCl2转化法（化学方法） 高压电穿孔法转化 显微注射法转化 基因枪法 一、 CaCl2转化法 感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为最适摄取和容纳外源DNA的生理状态 。 目的：增加受体菌细胞膜的通透性。 CaCl2转化法基本原理 1970年建立此技术，Ca2+诱导的完整细胞的 转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌） CaCl2转化法要点： 1.培养对数生长期细菌：OD600 = 0.4-0.5； 2. 冰浴0℃ CaCl2处理； 3.获得感受态细胞：收集菌体、 用冰冷的CaCl2 悬浮、分装细胞。 低温保存12 - 24小时。 4. 42 ℃ 热休克处理1-2min； 5.恢复培养：加入无抗生素培养液37 ℃培养1h 6.筛选转化子：用含抗生素的培养基培养10h。 二、电击法（electroporation）or电穿孔法 三、显微注射法（microinjection） 使用极细的毛细管在显微镜下将目的DNA注射到动物细胞或植物原生质体的一种直接方法。 直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。 优点：可操作性强，转化率高。 缺点：需有相当精密的显微操作设备，操作繁琐 四、基因枪法（gene gun）-微弹轰击法（particle-bombardment） 将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒（0.6-1um）表面，然后在高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞整合到染色体上并表达，实现基因的转化。 重组子（recombinant）：含有重组DNA分子的转化子。 不同抗性遗传标记的使用： 1、Ampr：表达产生β-内酰胺酶，降解Amp， 使用浓度：30-50ng/ml 2、tetr：编码改变细菌膜的蛋白，阻止Tet进入细 胞， 使用浓度：12.5-15.0ug/ml 3、Cmpr:cat基因转译氯霉素乙酰转移酶（CAT ），使 Cm乙酰化而失效，终浓度：30ug/ml 4、Knr：编码修饰卡那的酶，阻止kn对核糖体的干扰，终浓度：5ug/ml 2、lacZ’基因插入失活 菌落蓝白选择 3、插入表达筛选法：外源基因插入后激活标记基因表达，据标记基因的表达产物进行筛选。 标记基因上游存在负调控序列：如CI基因在terr上游，抑制terr基因表达，DNA插入CI内， CI基因失活，terr表达。 三、菌落原位杂交法（in situ hybridization） Southern blotting 核酸探针（probe）的制备 探针: 带有检测标记能够与目的基因或目DNA片段同源互补的一段核苷酸序列。 可以是DNA也可以是RNA；长度一般50-300bp 四、 免疫化学检测法 五、结构分析筛选 重组质粒的酶切 重组质粒的PCR扩增 练习题 1.重组体克隆的筛选和鉴定的方法有哪些，并说明其筛选原理或过程。 2.重组DNA导入受体细胞的方法及其原理。 对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 1、放射性抗体检测法 待测基因 产物蛋白 一抗 125I标记的二抗 固相支持滤膜 2、免疫沉淀检测法 方法： 把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。 抗原——抗体凝集反应。 检测分泌型产物。 对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理。 免疫印迹（western blotting）、ELISA 。 1、酶切方法检测质粒是否含有插入子。 单酶切、双酶切，比较DNA带数和长度 3、PCR扩增鉴定筛选 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片段。 2、电泳检测质粒的大小变化，推测是否包含插入子。 自身环化、载体部分缺失、未完全消化、多连体、两载体连接 Marker 23.1 9.4 6.6 4.4 2.3 2.0 M 1 2 3 5 6 pBSKS 1、2、5、6 是需要的扩增质粒 1# 2# 3# 4# 5# 6# M pBSKS 1、2、3、 5、6质粒可能是目标的扩增质粒 六 、转译筛选法 借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转译，筛选其产物是否符合预期的结果。 无细胞翻译系统：能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。如：麦胚提