农杆菌介导遗传转化原理.pdfVIP

农杆菌介导的 植物遗传转化 农杆菌的分类 ⾰兰⽒阴性菌、杆状； 按侵染植物的后果分为： •根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens ） 形成冠瘿（crown gall） •发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes ） 形成发根（hairy root） 按合成/代谢冠瘿碱 （Opine）的种类，根癌农杆菌分为 ： •章⻥碱（Octopine）型 •胭脂碱（Nopaline）型 •农杆碱（Agropine ）型 冠瘿碱： 农杆菌的碳源及氮源，其他物种不能代谢利⽤， 使农杆菌拥有了独特的⽣态位。 未侵染时栖息于⼟壤表层，侵染植物导致冠瘿病 （根癌病）； 侵染植物受伤部位（嫁接、修剪或其他外⼒伤害 等）； 冠瘿瘤⼀般位于主根与茎的结合部（树干基部， 即冠、Crown），但侧根、茎、枝上也有发病。 The Plant Cell, Vol. 18, 3350–3352 冠瘿病的害处： 苗⽊感病后发育受阻；⽣⻓缓慢；植株矮⼩；严重 时叶⽚萎蔫、早衰，甚⾄死亡；
 ⼤树受害后树势衰弱，⽣⻓不良，提前落叶，果实 变⼩，树龄缩短。主干受害降低材质及⼯艺价值。 农杆菌能够导致植物产⽣冠瘿病的原因： Ti （Ri）质粒 •根癌农杆菌含有Ti质粒 Ti ：tumor-inducing •发根农杆菌含有Ri质粒 Ri ：rhizogenic •天然农杆菌都含有Ti （或者Ri ）质粒 天然Ti质粒的结构 200〜800 Kb T-DNA区 （Transferred DNA）： 农杆菌Ti质粒中向植物中转移并整合进植物基因 组中的部分； 含有冠瘿碱合成基因、⽣⻓素合成基因、细胞分 裂素合成基因等； 真核启动⼦； •T-DNA区⼤⼩：10〜30 Kb •有的Ti质粒只含有⼀个T-DNA区，有的则含有多个； T-DNA 区的左右边界序列⾼度保守，为25bp 的正 向重复序列； /d/d/gene/Chapt17/BIO7.asp 毒性蛋⽩区 （Vir 区，Virulence）： 包括A 、B、C、D、E、F、G等基因区，有的 基因区含有多个基因，形成Operons ； Vir 区约20Kb ； 冠瘿碱代谢基因 农杆菌转化植物的过程 •植物受伤部位酚类化合物的分泌 •附着（chvA、chvB ） •VirA/G的双组分系统感受受伤信号 （signal to A Pi to G ） •其他Vir基因的表达 •T-DNA链的切出（VirD1+VirD2 ；Border to Border ） •T-complex的形成 •运输（从细菌中输出、进⼊植物细胞、⼊核） •整合 •农杆菌的附着 植物受伤后的分泌物中含有酚类物质（包括⼄酰 丁⾹酮，acetosyringone ，AS）； 这些酚类物质可以被农杆菌感知，借助于趋化性 迁移⾄植物受伤部位； 在ChvA 、ChvB （染⾊体毒性基因）等的帮助 下，附着到受伤部位； A. tumefaciens形态 农杆菌在ChvA、ChvB等 蛋⽩帮助下附着在植物细 胞表⾯ •毒性蛋⽩基因的激活 VirA识别植物受伤后 分泌的酚类物质信 号，并⾃我磷酸化， 进⽽将磷酸化信号传 给VirG ； VirG磷酸化后被活 化，作为转录因⼦启 动或增加各毒性蛋⽩ 的表达； /d/d/gene/Chapt17/BIO7.asp •T-complex形成 VirD2在D1的帮助下 识别T-DNA 25bp边 界序列，利⽤外切 核酸酶的在第3 、