实时荧光基因相对表达数据处理△△CT.doc

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）数据处理 相对定量△CT 和2-△△CT方法 一、实时荧光原理及其中的概念 实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）作为分子生物学实验中强大快速的一种检测手段，已经被广泛应用于临床和普通实验室。废话不多说，简单介绍一下其原理，和两个基本概念Ct（Cycle threshold）和扩增效率，然后详细解释一下相对基因定量的方法。 实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析qPCR中常用的荧光染料为SYBR Green I ，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，因此在 n 扩增曲线可以分为：图3 基线期 ：-荧光信号在最初的数个循环里变化不大，接近一条直线，称为基线。 对数期 ：-继基线之后，扩增进入到指数增长期，像细菌的繁殖曲线 平台期 ：-随着扩增的循环增加,引物,dNTP的消耗殆尽,不会再有新的DNA链产生了,就平台期了Cycle threshold value）：实时荧光PCR过程中，扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环数。起始模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。 扩增效率E（efficiency）：理想的PCR反应在指数期应该是Rn=R0 * 2n（Rn，n次循环产物量。R0，初始模板量。n，循环次数） 因为每扩增一次PCR产物就会变为上次的2倍。但是在实际PCR扩增中E基本在0.65-0.9。因此每个PCR反应的效率不一定都相同。因此，扩增公式可以写成 ：Rn= R0*（1+E）n 二、2-△△CT数据处理的方法 基因定量包括绝对定量和相对定量。绝对定量就是标准曲线法，这里不详细介绍，可以问度娘。绝对定量法比较费时费力，除了特殊情况，相对定量的方法也可以达到实验目的。在相对基因定量方法中，目前被广泛采用的就是2-△△CT法endogenous control）有相同相近的扩增效率E。 扩增效率的推算： 1．公式法 Rn= R0*（1+E）n 对两边取对数 lgRn = lg (1+ E) ? n +lgR0 n=CT时候 lgRct = lg (1+ E) ? CT +lgR0 由可知 lgRn为lg (1+ E)即公式 的斜率S。 因此得到 E = 10s-1 由公式可知lgRct = lg (1+ E) ? CT +lgR0 所以 ： lgR0 是和CT 成正比的，这也是可以根据CT值判断初始模板量的原理。 2．观察法 观察目的基因和内参基因的扩增曲线，如果指数期的曲线形状一致，可以认为两个基因的扩增效率类似。这对于做很多基因的扫描绘制基因热图很实用也很简单，省去了每个基因的扩增效率的确定。如下图4 上面的作为理解实时荧光PCR的基础，下面说一下具体试验中的应用 三、2-△△CT方法实用举例 例一 用药物处理肺癌细胞，计算处理对UTF-1 mRNA的影响。药物处理和未处理样品CT 值分别23.5 ，28.3。药物处理和未处理样品内参基因β-action的CT分别为19.5，21.3 处 理 组 △CT =23.5-19.5=4 未处理组△CT=28.3-21.3=7 △△CT=处理组△CT-未处理组△CT=4 - 7= -3 2-△△CT=2-(-3) =8 药物处理UTF-1基因表达变化倍数=2-{[处理UTF-1CT-内参CT]-[未处理UTF-1CT-内参CT]} =2-{[23.5-19.5]-[28.3-21.3]} =2- (-3) =8 因此可以理解为药物处理使UTF-1的表达是未处理的8倍 如果2-△△CT计算下来是2-3，那么可以解释为处理的是未处理的1/8，或者说处理后目的基因表达下降8倍 例二 如果5例HER2（+）组和5列HER2 （–）组Bcl-2基因和β-action的CT值已被测定如何评价HER2（+）组Bcl-2的表达是HER2(-)组的多少倍？ 因为不知道阳性组5例对应阴性组5例作△△CT，所以要用到：2-△CT转换数据用mean ± sd 表示 2-△CT=2-[CTbcl-2-CTβ-action] CTBcl-2 CTβ-action △CT 2-△CT HER2