05核酸分离检测.ppt

第五章核酸的分离与检测 一、核酸的分离、提取通则 核酸在细胞中通常与各种蛋白质结合在一起。 分离原则：保证核酸分子一级结构的完整性；排除其他分子污染。 分离与纯化的方法一般包括细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。 1. 细胞裂解 机械作用：低渗、超声、微波、冻融裂解和颗粒破碎等。不适于高分子量长链核酸的分离。 化学作用：一定p H 和变性条件下，细胞破裂，蛋白变性沉淀，核酸→水相。变性条件：加热、表面活性剂(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 等) 、强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍等) 。p H 环境：强碱(NaOH) 或缓冲液 ( TE、STE 等)。 金属离子螯合剂( EDTA 等) 螯合Mg2+ 、Ca2+，抑制核酸酶活性。 酶作用：溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶)破裂细胞。降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。 联合使用：细胞、待分离核酸类型及后续实验目。 2. 酶处理 裂解液中加入蛋白酶（蛋白酶K 或链酶蛋白酶） ，降解蛋白质；灭活核酸酶（DNase 和RNase） 加入DNase 和RNase 去除不需要的核酸。 防止核酸的降解和变性 防止过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏（一般在 pH 4-10下进行） ; 避免剧烈搅拌； 防止核酸酶（DNase , RNase ）的作用。 抑制DNase： 可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）；或加蛋白变性剂。 抑制RNase： 实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用 具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethyl pyrocarbonate, DEPC）处理。 加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。 加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的抑 制剂。 质粒DNA的提取——碱裂解法 溶液I：50 mM葡萄糖， 25 ，10 mM EDTA，pH 8.0—— Tris-Cl→ pH；葡萄糖→大肠杆菌悬浮；EDTA →金属离子螯合剂。 溶液II：0.2 N NaOH ， 1% SDS——NaOH →碱裂解细胞，控制时间，温柔混合 ； SDS →结合蛋白。 溶液III：3 M 醋酸钾 ， 2 M 醋酸——醋酸钾 →PDS沉淀；醋酸→ 中和碱。 3. 核酸的分离与纯化 高电荷磷酸骨架比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性。 根据理化性质差异，选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法。 ①酚提取/ 沉淀法 经典方法是酚:氯仿抽提法。 裂解细胞；离心分离含核酸水相；等体积酚:氯仿:异戊醇(25 :24 :1 体积) 混合液抽提，漩涡振荡混匀(小分子量核酸) /颠倒混匀(高分子量核酸) ，离心分离；疏水性的蛋白质→有机相，核酸→上层水相。 缓冲液饱和酚——蛋白变性；氯仿增加有机相比重，防止酚流入水相；异戊醇可减少操作过程中产生的气泡，下层的界面更清晰 。 核酸盐经有机溶剂沉淀浓缩 酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀 水相加p H5. 0～5. 5，终浓度0. 3M NaAc 或KAc （钠离子中和核酸磷酸骨架负电荷，在酸性环境中促进核酸疏水复性），加2～2. 5 倍体积乙醇，沉淀核酸。 离心收集， 70 %乙醇漂洗核酸沉淀除盐分。 其他可用于沉淀核酸的有机溶剂： 异丙醇、聚乙二醇( PEG) 等；盐类：10. 0mol/ L 醋酸铵、8. 0mol/ L 的氯化锂、氯化镁和低浓度的氯化锌等。 分离沉淀DNA ②层析法 利用物质些理化性质差异建立的分离分析方法。 包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等。 商品试剂盒，分离和纯化同步进行。 一定离子环境下，核酸被选择性地吸附到硅土、硅胶或磁珠等表面与其他生物分子分离。结合至固相载体的核酸可用低盐缓冲液或水洗脱。 核酸质量好、产量高、成本低、快速、简便、节省人力以及易于实现自动化。 Promega 质粒纯化系统 以磁性颗粒为基础：采用磁性技术高通量纯化直接用于转染及其它生物学实验的质粒。 以膜为基础：采用硅化膜纯化柱，可用离心法进行纯化。 以树脂为基础：利用树脂，真空法。 DNA在高盐条件下对硅树脂、膜的高亲和力。 全自动核酸分离纯化系统 二、核酸含量的测定 核酸是由磷酸、戊糖、碱基所组成的核苷酸的多聚高分子。三者以等分子数而存在，所以只要测定三者中任何一处成分的含量，就可推算出核酸的含量。常用的核酸测定方法有 ： 紫外吸收法 、定磷法、定糖法 RNA的定量测定：地衣酚法 DNA的定量测定：二苯胺法 紫外吸收法中DNA或RNA的定量 A260=1.0相当于: 50μg/ml双链DNA 40μ