PCR扩增CDNA库中的特异序列策略(论文资料).pdfVIP

中国试剂网 3.9.59 PCR 扩增 CDNA 库中的特异序列策略 最常用的基因分离方法需要建立组织或细胞 RNA 的 cDNA 库，然后用抗体或 DNA 探针筛选出感兴趣的基因。虽然这个方法已成功地克隆了大量基因，但建 立和筛 选 CDNA 库是一项非常耗时．费力的工作，而且用寡聚核苷酸作探针进 行筛选需大量蛋 白质序列结构的资料。聚合酶链的反应 （PCR ）方法可使一种 特异 DNA 扩增几百万倍， 并已成为分子克隆和诊断的十分有用的工具。最近， TAQDNA 聚合酶的使用极大地简化 了PCR 方法。该酶在 75℃左右有很宽的最 适温度区，在小于 95℃以下重复保温仍能存 活，更重要的是，该酶活性高，无 外切酶活性，因此理论上不用通过建立和筛选基因 库的所用步骤就能从序列编 码的基因作模板以探索一种简单．快速的基因分离方法。 下面我们将描述在鉴 定南美蝙蝠唾液腺外分泌蛋白中使用的方法和过程。 Dr.S.Gardell(MSDRL，WestPoint ，PA 纯化了从南美蝙蝠唾液腺中分离的一 种外 分泌蛋白，因此其部分肽序列(GlyLeuGlyCysAspLeuMet 是开始本实验的关 键。为检 验不用传统筛选方法即能克隆该蛋白基因的假说，我们采取了如下策 略: a).在 Lambdagt22 中建立一个在蝙蝠唾液腺中所有转录子的cDNA 库，并在 边侧加 上 SP6、T6 聚合酶启动子，这样可以直接用两种启动子序列之一作引物 进行扩增和测 序。 b).合成四组引物，组合起来代表已知的部分蛋白序列的全部有效密码子组合 (1024 种衍生列 。C).这些引物与适当的 T7 或 SP6 聚合酶序列引物组合成对，以 总 cDNA 库作模板，进行PCR 扩增。所得到PCR 产物应该代表编码该蛋白的部 分 cDNA 。对这些 PCR 产物直接测序应能得到足的序列信息以合成同源引物， 进一步进行 PCR 扩增，产生 的 DNA 片段结合起来可给出编码该蛋白的 cDNA 的完整序列。 直 接 用 2% 琼 脂 糖 凝 胶 分 析 PCR 产 物 ， 组 混 合 引 物 [ 引 物 1:5(CT)TXGG(ACGT)TG(CT) GA (CT)(CT)TXATG3，。每组混合引物产生约 450bp 和 550bp 的两个产物。用Wong 等所 述的方法进行凝胶纯化和测序该 PCR 的主要产物 450bp 带。混合引物产生清蜥可读的序 列(约 200 个核苷酸 ，虽然 可有 256 种引物组人合(简并度 。在这个序列信息的基础 上，合成另两组引物[引 中国试剂网 3.9.59 物Ⅱ(正向)]分别与 SP6 或 T7 聚合酶序列引物配对，按前面所 述进行 PCR 扩增， 引物Ⅱ/SP6 和引物Ⅲ/T7 分别产生 270bp 和 420bp 片段，测定这两个片 段序列， 与最初得到的 DNA 片段结合来，得到一个467bp 编码序列。该cDNA(270BP+420 bp 的多余序列为200bp 的PolyA 尾序。 PCR 策略 (A)n、(C)n、(G)n、(T)N: 同聚物序列 SP6，T7:SP6 和 T7 聚合酶启动子，分 别构建 入 Lambdagt 载体。B.琼脂糖凝胶分析 PCR 产物。PCR 在总体积 100µl， 含 50mMKCL、 10mMTris ，pH8.3 ，1.5mMMgCl2，0.01% 明胶，200µM 每种 dNTP， 2.5uTup 聚合酶， 150ng 噬菌体库模板 DNA ，50ng(0.1nmoles 每种引物的体系中 进行。程序如下:初始模 板