PCR技术应用四遗传病诊断(论文资料).pdfVIP

中国试剂网 3.9.56 PCR 技术应用四：遗传病诊断 自从1985 年 PCR 技术首次应用于遗传病基因诊断以来，已有近百种遗传病可用 PCR 技术进行诊断和产前诊断，利用PCR 技术诊断遗传病的途径有五个，①基 因突变位点 的直接检出②筛查与遗传病③④有关的点突变③遗传多态性标记连 锁分析间接诊断④ 利用 cmRNA 逆转录为 cDNA 进行分析或直接分析 cmRNA. 传统的基因诊断技术主要是以基因探针技术为基础而建立的一些检测方法， 包括 Southerninnouthern 印迹杂交，RFLP 为，它们可直接分析基因的缺失和重 排，亦可利 用 RFLP 时行连锁分析，但由于这些技术操作繁琐，探针来源困难 所需设剂昂贵，且要 用同抗素.完成一项诊断需要的时间亦较长，因此难于满足 临床诊断的要求.限制了它 在临床上的应用.PCR 技术是一种在体外的海促 DNA 合成技术，它能在短时间内将靶DNA 扩增百万倍，而且操用简便，省时，准确 性也高，它不仅能直检突变基因，而且可与 其它技术结合，使其诊断的准确性 几达 100%.而且不同同位素操作.能最大限度的满足 临床诊断的需要.因而它已 成为目前遗传病诊断的产前诊断的主要手段. 一、PCR 技术诊断遗传病的基本条件 PCR 技术的基本原理是利用一对引物为介导，在体外模拟天然DNA 复制过 程的技 术，从生化的角度来看，它是一种海促反应，因此其反应的过程中必须 有酶的底物， 在这里酶为 DNA 聚合酶，没酶是有耐热性，底物为 4 种脱氯乙 磷酸核菌酸.它所需要的 另一条件为引物，引物是根据已知的基因片段合成的一 段 20 时左顺的互解序列，因 此，要进行 PCR 检测，除了具备酶，底物及其它 基本因素外，利用已知的基因结构合 成一对引物是 PCR 诊断遗传病的最基本条 件，也就是说，说遗传病的基因结构必须部 分或全部清楚. 二、利用 PCR 技术诊断遗传病的途径 一)PCR 技术直接诊断遗传病 对于由基因缺失突变引起的遗传病可利用缺失区域还侧的 DNA 序列引物直 接扩增 该区域，看有无特异性的扩增产物，这对缺失部位固定的片段检测非常 准确简便，只 需一对引物即可完成，而对于哪些缺失部位异质的基因则可利用 多对引物进行多重 PCR ，然后检查缺失带.对基因的重排来说，可通过用RT-PCR 检测 mRNA 的融合情况来检 出，括入亦可用 PCR 方法来检出，当点突变影响 中国试剂网 3.9.56 到限制内性切酶切点时，可用 PCR-RFL P 进行分析，即将扩增产物用适当的内 切酶切割，然后据电泳图谱复制判断有无内切 酶切点的改变，它比传统的 RFLP 检测法快速简便，且不受同位素的危害.若突变优点 及性质已知.可用 PCR-ASO ， 3特异 PCR 及引物镱争法进行确定，而对于突变优点不清 楚或突变优点多变的 基因则可用 PCR-SSCP ，DGGE ，CDGE，TGGE，PCR-RNSE 切割，化简 错配 切割，异源双链分析长久法进行筛选与遗传病有关的点突变，再用 PCR 循环直 接 测序确定突变部位和性质. 二)利用连锁分析间接诊断遗传病 在有的遗传病其基因结构庞大，基因的分子病理改变复杂或不清楚，或异质 性较 高，利用 PCR 技术直接检测与遗传病有关的基因点突变有一定的困难.常 常利用一些基 因内或其旁侧的一些多态性标记进行连锁分析，以间接判断遗传 病，常以 PCR 方法进 行检测的多态性标记有以下两种. 1.PCR-RFLP 在人类基因组中存在着许多限制性内切酶切点，这些切点在人群中具有明显 的遗 传变态性.因此可用已知 D