PCR技术应用进展(论文资料).pdfVIP

中国试剂网 3.9.48 PCR 技术应用进展 PCR 技术自 1985 年建立以来，发展之迅速、应用之广泛，表明其具有强大的生 命力.近些年来，基于PCR 的基本原理，许多学者充分发挥创造性思维，对PCR 技术进行研究和改进，使 PCR 技术得到了进上步地完善，并在此基础上派生出 了许多新的用途. 原位 PCR 技术 原位 PCR 就是在组织细胞里进行 PCR 反应，它结合了具有细胞定位能力的 原位杂交和高度特异敏感的 PCR 技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里 的一项有较大潜力的新技术. 原位 PCR 是 Hasse 等于 1990 年建立的，实验用的标本是新鲜组织、石蜡包 埋组织、脱落细胞、血细胞等.其基本方法为①固定组织或细胞:将组织细胞固定 于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过 氧化物酶.②蛋白酶 K 消化处理:用 60ug/ml 的蛋白酶K 将固定好的组织细胞片 55 ℃消化处理 2h 后，96 ℃2min 以灭活蛋白酶K.③PCR 扩增:在组织细胞片上，加 PCR 反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行 PCR 循 环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR 的装置.④杂交:PCR 扩增结束后， 用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交.⑤显微镜观察结果. 原位 PCR 既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位 置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的 实用价值.其特异性和敏感性高于一般的 PCR. 连接酶链反应 连接酶链反应(Ligasechainreaction，LCR) ，是一种新的DNA 体外扩增和检 测技术，主要用于点突变的研究及靶基因的扩增. 连接酶链反应是 Backman1997 年为检出靶基因序列中的点突变而设计发明， 并申报了专利.1988 年Landegren 也进行了该项研究.1988 年Backman 等又因分离 热稳定的连接酶，而申报专利，1991 年 Backman 和 Barany 分别用耐热 DNA 连 接酶进行了 LCR 试验.耐热 DNA 连接酶可以在热循环中保持活性，提高连接反 应的特异性，排除了背景扩增和免除了不断补充酶的繁琐程序. LCR 的基本原理为利用DNA 连接酶.特异地将双链 DNA 片段连接，经变性 中国试剂网 3.9.48 退火连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增.其程序为:在模 DNA 、 DNA 连接酶、寡核苷酸引物以及相应的反应条件下，首先加热至一定温度下 (94～95℃)使 DNA 变性，双链打开，然后降温退火(65℃) ，引物与之互补的模板 DNA 结合并留下一缺口，如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序列完 全互补，DNA 连接酶即可连接封闭这一缺口，则 LCR 反应的三步骤(变性退火 连接)就能反复进行，每次连接反应的产物又可在下一轮反应中作模板，使更多 的寡核苷酸被连接与扩增.若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确 结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成 连接产物. LCR 的引物是两对分别互补的引物，引物长度为20～26 个，以保证引物与 靶序列的特异性结合，LCR 识别点突变的特异性高于 PCR ，其特异性首先取决 于引物与模板的特异性结合，其次是耐热连接酶的特异性.LCR 连接反应温度接 近寡苷酸的解链温度(Tm)，因而识别单核苷酸错配的特异性极高. LCR 的扩增效率与PCR 相当，用耐热连接酶做 LCR 只用两个温度循环，94 ℃min 变性和 65℃复性并连接，循环 30 次左右.其产物的检测也较方便灵敏. 目前 该方法主要用点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用 于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因 的点突变研究等. 依赖核酸序列的扩增 依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequencebased amplification，NASBA) ， 又称自主序列