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上海美季生物技术有限公司 Real-time PCR 详细介绍 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、 自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。 一. 实时荧光定量PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监 测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold， Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图 1所示）。 图1. Ct值的确定 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的 荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´ SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系 〔 〕 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系 ，起始拷贝数越多 ，1 Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数， 上海美季生物技术有限公司 Tel :021Fax:021Email:info@ 上海美季生物技术有限公司 纵坐标代Ct值（如图2所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该 样品的起始拷贝数。 图2. 荧光定量标准曲线 4. 荧光化学 〔 〕 2 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料 。现将其原理简述如下： 1）TaqMan荧光探针： PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别 标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团 吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光 基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成 ， 实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如图3所示。 上海美季生物技术有限公司 Tel :021Fax:021Email:info@ 上海美季生物技术有限公司 上海美季生物技术有限公司 Tel :021Fax:021Email:info@ 上海美季生物技术有限公司 图3. TaqMan 荧光探针工作原理 2）SYBR荧光染料： 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧 光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。 二．内标在传统定量中的意义