EGCG对人皮肤细胞辐射防护作用与机制研究.pdf

EGCG 对人皮肤细胞的辐射防护作用及机制研究 中文摘要 中文摘要 目的 研究 EGCG 对人皮肤 HaCaT 细胞放射敏感性的影响，进一步探讨表没 食子儿茶素没食子酸脂 （EGCG ）对人正常皮肤角质细胞 HaCaT 的辐射保护作用 及其机制。 方法 选取人永生化正常皮肤角质细胞 HaCaT 作为实验细胞。（1）利用四氮 唑盐比色试验（MTT ）测定 EGCG 或联合 X 射线对 HaCaT 细胞活力的影响，筛 选出合适的 EGCG 的浓度进行后续的实验；（2 ）给予不同剂量X 射线照射，应用 克隆形成实验，检测 EGCG 对 HaCaT 细胞存活分数及放射敏感性的影响；（3 ）流 式细胞术检测 EGCG 联合 X 射线作用后，HaCaT 细胞凋亡及周期分布的改变情况； （4 ）荧光显微镜观察EGCG 联合 X 射线后 HaCaT 细胞线粒体及 ROS 的变化；（5 ） 应用 Western-blot 法分析 EGCG 联合 X 射线作用后，细胞凋亡相关蛋白 Bcl-2 、Bax 及氧化应激相关蛋白 HO-1、SOD 等的表达水平的变化；（6 ）免疫荧光实验检测 Nrf2 表达变化；（7 ）MTT 法检测 HO-1 siRNA 或 SnPP 联合 EGCG 后辐射防护作 用；（8 ）荧光素酶活性检测 HO- 1 的诱导表达；（9 ）免疫组化法观察 EGCG 对皮 肤的诱导表达。 结果 （1）MTT 检测结果显示：EGCG 在 0-75µmol/L 浓度范围内联合 X 射 线可减轻辐射导致的 HaCaT 细胞活力下降，而没有明显毒性作用；（2 ）细胞辐射 敏感性实验结果显示：EGCG 联合辐射组细胞相比单纯照射组，细胞克隆形成率 均明显提高（P0.01 ）。对于HaCaT 细胞，单纯照射组和药物+照射组平均致死剂 量（D ）值分别为2.43Gy、2.63Gy，准阈剂量（D ）值分别为 1.78Gy、2.53Gy； 0 q （3 ）Annexin Ⅴ/PI 双染法凋亡检测结果显示：对于 HaCaT 细胞，单纯 10、20Gy 照射组细胞凋亡率分别是 9.25%和 12.41%，10Gy 组经 50µM EGCG 处理后，细胞 凋亡率分别降低至 7.82%和 10.24%，20Gy 组经 50µM EGCG 处理后，细胞凋亡率 分别降低至 6.34%和 8.00%，差异有统计学意义(P0.01) ；流式细胞仪分析细胞周 期显示：在照射剂量点，对于 HaCaT 细胞，EGCG+照射组与单纯照射组相比，G /G 0 1 期细胞比例上升（p 0.01 ），G /M 期细胞比例下降，G 期阻滞缓解，差异有统计 2 2 学意义（p 0.01 ）；（5 ）Western-blot 分析显示：对 HaCaT 细胞，与单纯照射组 I 中文摘要 EGCG 对人皮肤细胞的辐射防护作用及机制研究 相比，EGCG+照射组的 Bcl-2 蛋白表达水平下调，Bax 蛋白表达水平增加，而细胞 氧化应激相关蛋白 HO-1 的表达量上升，而 SOD 没有明显改变； （6 ）免疫荧光实 验检测结果显示：EGCG+照射组 HaCaT 细胞使Nrf2 转录调控因子向核内转移；（6 ） MTT 法显示 HO-1 siRNA 或 SnPP 联合 EGCG 后辐射防护作用减轻；（7 ）荧光素 酶活性检测 EGCG 可以诱导 HO-1 的表达；（8 ）免疫组化法观察EGCG 可诱导大 鼠皮肤组织的HO-1 的表达。 结论 EGCG 对人皮肤 HaCaT 细胞具有辐射保护作用，EGCG 可能通过清除 X 射线引起的 HaCaT 细胞内的自由基，缓解 G2 期阻滞，改变凋亡调控蛋白 B