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高效液相色谱法分析芳香类化合物 化学物理系 焦峰 P 2012年4月 28日 实验目的 了解高效液相色谱仪的基本结构及基本作用； 了解色谱分离的基本原理，尤其是反相色谱的基本规律； 掌握色谱的基本定性、归一化定量方法。 实验原理 以液相为流动相的色谱称为液相色谱。广义的讲，可以分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱。如果按照两相分离过程的物理化学原理进行分类，可分为吸附色谱、分配色谱、凝胶色谱、离子色谱、亲和色谱等。 吸附色谱法又称为液固色谱法，是液相色谱法中发展历史最长的一种方法。液固色谱法的固定相为固体吸附剂，常用的是碳酸钙、硅胶、三氧化二铝、氧化镁、活性炭等。固定相的表面存在着分散的吸附中心，溶质分子和流动相分子在吸附剂表面呈现的吸附中心上进行竞争吸附，溶质分析反复的被吸附，又反复的被流动相分子顶替解吸，随着流动相的流动而在柱子中向前移动。由于不同的待测分子在固定相表面的吸附能力不同，使得吸附-解吸附的速度也不同，导致各组分洗出的时间不同，实现各组分物质被分离，所以溶质分子和流动相分子在吸附剂表面的吸附-解吸附平衡就是液固吸附色谱具有选择性分离的基础。 分配色谱是基于样品分子在包裹与惰性载体（基质）上的固定相液体和流动相液体直接按分配平衡的色谱方法，又称为液液色谱法。在固液色谱中使用的固体吸附剂，如全多孔球形、无定形微粒硅胶、全多孔氧化铝等皆可作为液液色谱固定相的惰性载体。但作为固定相的液体往往容易溶解到流动相找哦那个去，导致保留值减少，柱效下降，使得重复性很差，不大方便人们所采用。直到化学键合固定相的出现，才使液液色谱得到广泛应用。化学键合固定相是将固定相通过化学结合的方法结合到惰性载体上，这样固定相就不会溶解到流动相中。常见的化学键固定相有十八烷基三氯硅烷等，它是将十八烷基三氯硅烷通过化学反应与硅胶表面的硅羟基结合，在硅胶表面形成化学键合态的十八碳烷基，其极性很小，而常用的流动相，如甲醇、乙腈以及它们和水的混合溶液，极性比固定相大，因此成为反相高效液相色谱；反之流动相的极性比固定相小，称之为正相高效液相色谱。 高效液相色谱适合于分析沸点高不易挥发、受热不稳定易分解的、分子量大的、不同极性的有机化合物，生物活性物质和多种天然产物，合成的和天然的高分子化合物等。它们涉及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物等，约占全部有机化合物的80%.。 仪器结构与原理 高效液相色谱仪最基本的组件是输液泵、进样器、色谱柱、检测器和工作站。输液泵将流动相以稳定的速度（或压力）输送至待分析体系，通过进样器，载着待测样品进入色谱柱。在色谱柱中，样品的各组分在色谱柱中被分离，并依次随流动相流至检测器监测到的信号送至工作站记录处理和保存。 储液灌 液相色谱中所使用的储液灌应耐腐蚀可以为玻璃、不锈钢、氟塑材料或特种塑料聚醚醚酮（PEEK），容积为0.5～2.0L。储液灌必须放置于高于泵体的位置。 输液泵 输液泵一般须具备以下特点 泵体材料耐化学腐蚀 能在高压下连续工作 输出流量范围宽 输出流量稳定，重复性高 进样装置 本实验中使用的进样装置是较为常见的六通阀进样器，样品的进样体积用定量管来确定。 色谱柱 色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。常用内壁抛光的不锈钢管座色谱柱管，其内径多为4.6mm或3.9mm，长度在10～15cm。色谱柱内部紧密填充着大量的5～10μm粒度的颗粒作为固定相。 检测器 检测器是用来连续监测经色谱柱分离后流出物的组成和含量变化的装置。它利用被监测物的某一物理或化学性质与流动相有差异的原理，当被监测物质从色谱柱中流出时，会导致流动相的背景发生变化，从而在色谱图上一色谱峰的形式表现出来。被实验中使用的检测器为紫外-可见光（UV-VIS）检测器，是目前在高效液相色谱中使用最广泛的检测器，它既具有较高的灵敏度和选择性，也有很广宽广的应用范围。由于UV-VIS对环境温度、流速、流动相组成变化不是很敏感，所以也可以用于梯度洗脱。 工作站 液相色谱的工作站主要是用进行数据的采集和处理，一般都可以在线模拟显示，数据自动采集、处理和储存，并可对整个过程实现自动控制。 数据的处理方式 本实验采用的定量分析方式为归一化法，把所有的组分含量之和按100%进行计算。归一化发的重要前提是样品中的所有组分都可以流出色谱柱，并在检测器上都能产生信号。由于存在杂质的原因，该方法并不能测定出样品中某组分的含量，只能测出个组分之间的含量之比。计算公式为 其中Ai为组分i的峰面积；fi为组分i的质量（或摩尔、体积）校正因子。 仪器与试剂 仪器：Agilent series1100型液相色谱仪：真空在线脱气装置；四元梯度泵；多波长检测器；ODS