慢病毒介导PTL基因干预星形胶质细胞在帕金森病模型中保护作用研究.pdf

慢病毒介导 PTL 基因干预的星形胶质细胞在帕金森病模型中的保护作用研究 中文摘要 慢病毒介导 PTL 基因干预的星形胶质细胞在 帕金森病模型中的保护作用研究 中文摘要 第一部分 大鼠 PTL 基因 RNA 干扰和过表达重组慢病毒载体的构建 目 的：构建胰甘油三酯脂酶(pancreatic triglyceride lipase, PTL)基因 RNA 干扰 慢病毒载体和胰甘油三酯脂酶基因慢病毒过表达载体及鉴定，并进行包装和生产高滴 度高纯度的慢病毒颗粒。 方 法：针对 PTL 基因序列，合成 4 对靶向大鼠 PTL 基因特异性干扰序列，其 两端含酶切位点粘端，直接连入酶切后的 RNA 干扰慢病毒载体 pLenO-THM 上。将 连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的克隆进行 PCR 鉴定和测序比 对后，鉴定阳性的克隆即为构建成功的重组慢病毒干扰质粒。以钙转法将重组质粒与 慢病毒包装质粒共转染 293T 细胞，包装生产慢病毒颗粒，并依据绿色荧光蛋白 (GFP) 表达水平检测病毒滴度；从含有 PTL 基因的质粒克隆模板 PCR 扩增后，将 PTL 基因 与 pLenO-DCE 载体分别进行双酶切。纯化酶切产物后进行定向连接或重组，其产物 转化细菌感受态细胞，对长出的克隆进行 PCR 鉴定、测序和分析比对，得到构建成 功的 PTL 慢病毒过表达载体，将其转染 293T 细胞，培养 48 h 后，荧光显微镜观察 融合蛋白 GFP/PTL 的表达。同时收集细胞培养上清液，将其浓缩后在293T 细胞中测 定病毒滴度。 结 果：成功构建 PTL 基因 RNA 干扰慢病毒载体和 PTL 基因慢病毒过表达载 体，PCR 和 DNA 测序证实阳性克隆序列正确，转染 293T 细胞后镜下可见荧光强度 强烈，并且能被高效转染，这样能确保病毒的稳定表达，表明病毒包装成功。病毒的 滴度大约在 2 ×108 TU/ml 。 结 论：成功制备PTL 的RNA 干扰和过表达重组慢病毒载体，为后续转染两型 星形胶质细胞以获得高效稳定的基因干预效果提供可靠技术，为更深入的研究 PTL I 中文摘要 慢病毒介导 PTL 基因干预的星形胶质细胞在帕金森病模型中的保护作用研究 基因干预后对星形胶质细胞及神经元细胞生物学特性的影响奠定坚实基础。 关键词：胰甘油三酯脂酶, 慢病毒载体, RNA 干扰, 基因过表达, 基因转染 第二部分 PTL 基因干预的星形胶质细胞生物学特性研究 目 的：将已成功构建的 PTL 基因 RNA 干扰慢病毒和过表达 PTL 基因慢病毒 颗粒分别转染 1 型星形胶质细胞 (type 1 astrocytes, T1As)和 2 型星形胶质细胞(type 2 astrocytes,, T2As)，观察其转染能力和报告基因的表达水平，分析这种干预对星形胶 质细胞生物学特性改变的影响，将 PTL 基因干预的星形胶质细胞与原代神经元共培 养，观察这种干预对神经元细胞生物学特性的影响。 方 法：将已成功构建的 PTL 基因 RNA 干扰慢病毒和过表达 PTL 基因慢病毒 颗粒分别转染星形胶质细胞，镜下观察上述感染后的星形胶质细胞 GFP 的表达、转 导效率，荧光定量 PCR 和 Western blot 分别检测 PTL mRNA 、蛋白的表达情况， MTT 法检测基因干预后星形胶质细胞的存活率，将 PTL 基因干预的两型星形胶质细胞分 别与原代大脑皮层神经元共培养，观察共培养后神经元的形态学变化，免疫荧光检测 各组神经元轴突生长相关蛋白 [神经丝蛋白 (NF-200) 、Ⅲ型β微管蛋白 (β-Ⅲtubulin) 和生长相关蛋白-43 (GAP43)] 的表达，Western blot 检测星形胶质细胞及神经元中胶 质源性神经营养因子[胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF) 、中脑星形胶质细胞源性 神经营养因子 (MANF)] 的表达水平。 结 果：(1) 转染 PTL RNA 干扰病毒的两型星形胶质细胞中 PTL 表达明显降低， 干扰效率达 90% 以上；而转染P