肺炎链球菌表面粘附素A原核表达和免疫的保护性初步及研究.pdfVIP

肺炎链球菌表面粘附素A的原核表达和 免疫保护性的初步研究 硕士研究生： 吴艳丽 指导教师： 罗 红 副教授 指导小组： 陈 晨 讲师 专业名称： 临床检验诊断学 摘 要 目的：肺炎链球菌(Streptococcus 然界，是一种条件致病菌，定植在40％健康人群鼻咽部，可以引起肺炎、 中耳炎、菌血症、脑膜炎等疾病。据统计在发展中国家，每年大约有500 万5岁以下的儿童死于肺炎链球菌引起的肺炎及脑膜炎。随着抗生素的 广泛使用，肺炎链球菌对青霉素耐药现象日益严重，且呈多重耐药，严 重影响治疗效果，因此应用疫苗进行有效的预防显得尤为重要。肺炎链 球菌有90多个血清型，其中近30个血清型对人有致病性，为细菌性肺 炎的主要病原体。目前使用的疫苗多为型特异性多糖疫苗，难以覆盖所 有血清型，且对2岁以下婴幼儿及老年人的保护效果不理想。因此，寻 找新的候选疫苗是有效预防细菌性肺炎的关键。 肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA)为肺炎链球菌的黏附分子，是该 菌所有血清型共有的一种遗传保守的、种特异性的表面蛋白抗原。PsaA 在肺炎链球菌黏附呼吸道粘膜过程中发挥关键作用，是主要的毒力因子 之一。PsaA抗原决定簇全部或部分暴露于细胞表面，具有较好的免疫原 性。因此，PsaA蛋白有可能作为肺炎链球菌候选蛋白疫苗的抗原，同时 还有可能用于检测患者血清中相应的抗体，为肺炎链球菌感染的快速诊 断提供依据。 本研究采取基因工程方法构建重组载体，经表达获得PsaA蛋白，并 利用动物主动免疫来初步验证其保护作用，研究其作为疫苗抗原的可行 性。 方法：1．psaA基因的克隆、表达：利用PCR技术从肺炎链球菌基因 组中扩增psaA片段，克隆后构建在原核表达载体pET．32a中；经测序与 GenBank数据库中肺炎链球菌全基因组的psaA片段进行比对，将含有目 的基因片段的重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表 达，饱和硫酸铵纯化蛋白；应用SDS．PAGE电泳技术对表达产物进行分 析，并用自制的小鼠抗血清进行Westernblot鉴定。 2．主动免疫实验：将40只昆明小鼠随机分为2组(每组20只)，分 4、2 别为生理盐水对照组和PsaA实验组。实验组分别于0、1l天经腹股 沟皮下注射PsaA蛋白，剂量为l 099／只／次，对照组注射无菌生理盐水。 免疫结束后第7天对两组小鼠经腹腔感染致死剂量肺炎链球菌，连续监 测21天，进行生存时间分析。 结果：1．psaA基因的克隆、表达：经快速PCR鉴定、酶切鉴定和基 因测序结果显示，肺炎链球菌psaA基因片段被正确克隆到pET-32a原核 合，无碱基突变；经IPTG诱导，重组质粒在BL2 1(DE3)菌中表达出了 原蛋白约20KD)，表达的蛋白以可溶形式为主，表达量约占全菌总蛋白 的60％，饱和硫酸铵纯化后纯度大于80％；重组蛋白能够与S．P免疫小 鼠的抗血清发生结合反应。 2．重组蛋白PsaA的主动免疫实验结果：以PsaA蛋白免疫的小鼠半 数生存时间与对照组相比明显延长(P0．001)。 结论：1．成功构建了pET-32a．psaA重组表达载体。表达的重组蛋白 PsaA具有良好的抗体结合活性。为肺炎链球菌感染的快速诊断抗原的制 备提供实验依据。 2．PsaA蛋白能够保护昆明小鼠抵抗致死剂量肺炎链球菌的攻击，具 有一定的免疫保护性，为肺炎链球菌蛋白疫苗的研制奠定了基础。 原核表达 关键词：肺炎链球菌 疫苗PsaA抗原性 and on study