石杉碱甲在脊髓器官型培养水平对运动神经元的保护作用与研究.pdf

中文 摘 要 石杉碱甲在脊髓器官型培养水平对运动神经元保护作用的研究 摘 要 肌萎缩侧索硬化(Am,otrophicLateralSclerosis,ALS)是选择性侵犯 上、下运动神经元的慢性进行性变性疾病。它是以进行性肌肉无力为特点 的致死性疾病，患者多在首次出现症状后的3-5年内死于呼吸衰竭。ALS 的发病机制可能主要集中在以下几个方面:1)Cu/ZnSOD基因突变;2) 谷氨酸的兴奋毒性作用;3)线粒体功能异常;4)氧化应激;5)病毒感染; 6)免疫异常等等。谷氨酸的兴奋毒性作用是散发性肌萎缩侧索硬化 (SporadicAmyotrophicLateralSclerosis,SALS)的重要发病机制之一， 在病理情况下，谷氨酸转运体功能受到明显抑制，细胞外谷氨酸浓度异常 增高，过度刺激其受体，对中枢神经系统有明显的兴奋毒性作用。 体外细胞 (或组织)培养尤其是脊髓的器官型培养在ALS的研究中 占有重要位置。在器官型培养的脊髓中，培养物能存活3个月以上，可以 显示出良好的细胞形态以及细胞与细胞之间的突触联接。ALS脊髓器官型 培养模型作为ALS的一种体外研究方式，它是利用脊髓器官型培养技术， 在培养液中加入谷氨酸转运体抑制剂，抑制谷氨酸的的转运，造成突触间 隙谷氨酸浓度的增高，根据谷氨酸的兴奋毒性机制，对腹角运动神经元造 成损伤。它可以作为一种良好的模型去研究具有神经保护作用的药物，从 而为临床前使用某些药物治疗ALS提供重要实验基础。 ALS治疗非常困难，ALS药物研究主要包括兴奋性氨基酸拮抗剂、 神经营养因子、抗氧化剂、钙通道阻滞剂、以及基因治疗等。利鲁哩 (riluzole)是兴奋性氨基酸拮抗剂之一，是第一个获美国FDA和欧盟批准 用于治疗ALS的药物。但它的疗效有限，仅能延长病人生命几个月，并 不能治愈ALS。进一步研究尤其从我国中药中研发新的治疗ALS药物非 常重要。 石杉碱甲(HuperzineA,HupA)是从民间草药千层塔(蛇足石杉)中分 离到的一种新型石松类生物碱有效单体，虽然它是一种可逆性的高效乙酞 胆碱醋酶抑制剂，但对石杉碱甲的药理作用深入研究表明，它还通过抗谷 氨酸的兴奋毒性作用、抗氧化应激、抗细胞凋亡等途径对细胞产生一定的 中文 摘 要 保护作用，同时还能够对抗许多毒剂诱发的神经细胞毒性，具有很强的神 经保护作用，值得研究推广。 因此，该课题根据谷氨酸的兴奋毒性作用机制，利用脊髓的器官型培 养技术，建立肌萎缩侧索硬化脊髓器官型培养模型;在腹角a运动神经元 受损的基础上，在培养液中加入不同浓度的石杉碱甲，观察石杉碱甲对腹 角a运动神经元的保护作用。课题研究分四部分:第一部分建立脊髓的器 官型培养技术，观察石杉碱甲在脊髓的器官型培养水平是否对腹角a运动 神经元产生毒性作用，为进一步研究其保护作用奠定基础;第二部分根据 谷氨酸的兴奋毒性作用机制，利用脊髓的器官型培养技术，建立肌萎缩侧 索硬化脊髓器官型培养模型。在腹角a运动神经元受损的基础上，在培养 液中加入不同浓度的石杉碱甲，从不同角度观察石杉碱甲在脊髓的器官型 培养水平对腹角a运动神经元产生的保护作用;第三部分在肌萎缩侧索硬 化脊髓器官型培养模型的基础上观察不同浓度的利鲁哩对a运动神经元 的保护作用，并以此为对照，比较石杉碱甲与利鲁哇的保护作用;第四部 分探讨石杉碱甲的a运动神经元保护作用韵机制。 一、脊髓器官型培养的建立及石衫碱甲毒作用探讨 目的:首先建立脊髓器官型培养技术并对脊髓腹角a运动神经元进行 鉴定。通过对脊髓片的形态学观察及计数腹角a运动神经元数目，探讨石 杉碱甲对培养的脊髓片是否具有毒性作用，为进一步研究石杉碱甲的保护 作用做前题准备工作。 方法:8日龄SD乳大鼠快速在75%酒精、碘酒、75%酒精中依次浸 泡消毒，断头，分离、取出脊髓，剪断腰段脊髓神经根，切成350}Lm厚 的薄片，分离成单片。6孔培养板内每孔放入 lml培养液ms，并放置 MilliporeMillicell-CMinsert，用吸管将脊髓片转移至insert上，每个insert 上放5片，入C02培养箱 (370C,5%C02.95%空气)。将脊髓片分为2 组:①正常对照组;0100limo1-L-1HuPA组。每日在倒置显微镜下观察 体外培养脊髓生长状态、每周测定面