糖调节蛋白78免疫的保护与免疫负调双重功能及在Ⅰ型糖尿病中作用及研究.pdf

中 文 摘 要 【目的】未折叠或错误折叠蛋白质在内质网腔蓄积及细胞内稳态的破坏将导致内 质网应激。适宜的应激有利于细胞内环境的恢复，然而严重而持久的内质网应激 反应将导致内质网功能受损，诱导细胞凋亡。β细胞具有高度发达的内质网，是 对内质网应激最敏感的细胞之一，内质网应激介导的β细胞凋亡参与了糖尿病的 发生与发展。糖调节蛋白78 （GRP78 ）是热休克蛋白70 家族的成员之一，作为 一种分子伴侣在蛋白质的折叠和转运过程及内质网应激反应中发挥重要作用，也 被称为内质网应激标志蛋白。本实验研究 GRP78 在链脲佐菌素（STZ）损伤糖 尿病小鼠胰岛β细胞不同时期表达变化，揭示其与胰岛β细胞内质网应激的关联； 研究GRP78 对胰岛β细胞的保护作用，及对STZ 诱导I 型糖尿病发生发展的影 响。 【方法】 1．STZ 诱导NIT-1 细胞与糖尿病小鼠胰岛GRP78 表达的检测 Balb/c 小鼠20 只,雄性,随机分为模型组15 只和对照组5 只。体内采用STZ 一次大剂量腹腔注射制备I 型糖尿病模型，分为第 1、7、14 天三个实验组，取 其胰岛备用；体外用STZ 处理NIT-1 细胞株（来源于非肥胖型糖尿病小鼠（NOD ） 胰岛瘤细胞株），分别在处理后2 、6、24h 收集细胞，柠檬酸缓冲液处理NIT-1 细胞作为对照。应用实时定量聚合酶链反应（real-time PCR ）方法检测 GRP78 mRNA 和CHOPmRNA 表达变化，应用免疫斑点（western blot ）方法检测其蛋 白表达，流式细胞术（FCM ）及荧光显微镜检测凋亡。比较STZ 处理后未发生 糖尿病小鼠与对照组小鼠的GRP78 蛋白水平。 2 ．GRP78 转染NIT-1 细胞及其凋亡的检测 用含 GRP78 基因的质粒转染 NIT-1 ，命名为NIT-GRP78, 作为细胞模型研 究GRP78 保护胰岛β细胞抵抗STZ,细胞因子（IL-1β+IFN-γ）和细胞毒性T 细胞 （CTL ）诱导的损伤作用。FCM 检测凋亡，real-time PCR 检测CHOPmRNA 的 表达，比色法检测NO 浓度和SOD 活性。 III 3 ．CTL 与细胞因子的检测 转染或未转染GRP78 基因的NIT-1 细胞免疫Balb/c 小鼠，取其脾细胞体外 再次刺激后作为效应细胞，以NIT-GRP78 和NIT-GFP 细胞为靶细胞，CFSE 与 PI 双染色 FCM 检测效应细胞对靶细胞的杀伤作用，ELISA 检测效应细胞分泌 IL-4 和IFN-γ水平，并且将转染和未转染基因的NIT-1 细胞移植入STZ 诱导的糖 尿病小鼠，观察移植前后的血糖、体重、糖刺激的胰岛素释放及生存时间。 【结果】 1．STZ 诱导NIT-1 细胞与糖尿病小鼠胰岛GRP78 表达 在受侵袭的胰岛β细胞GRP78 表达早期增高，但晚期显著下降。随着GRP78 的下降和CHOP 表达增高，细胞凋亡逐渐增加。特别有意义的是STZ 处理后未 发生糖尿病小鼠的GRP78 蛋白水平与对照组相比稳定增高，提示GRP78 蛋白的 表达可能对应激细胞具有一定程度的保护作用。 2 ．GRP78 对损伤因子诱导NIT-1 细胞凋亡的抵抗作用及其机制 在经过STZ 和细胞因子处理后，与对照组相比，转染GRP78 基因细胞培养 上清中NO （P0.05 ）水平降低，而SOD 活性增高(P0.05), 细胞内CHOPmRNA 水平亦较低（P0.05 ），细胞凋亡率显著下降(P0.01) 。与对照组相比，转染GRP78 基因的细胞对CTL 的抵抗力显著增强。 3 ．GRP78 对STZ 诱导I 型糖尿病小鼠发生发展的影响 通过转染或未转染GRP78 基因的NIT-1 体内外联合刺激获得的脾淋巴细胞， 分别与不同靶细胞体外共培养后，CFSE 与 PI 双染色 FCM 检测结果表明， NIT-GFP 细胞诱导的脾淋巴细胞介导 NIT-GRP78 靶细胞中度坏死，而介导 NIT-GFP 细胞有重度坏死；N