无乳链球菌Sip蛋白表达及免疫的保护性及研究.pdfVIP

摘要 无乳链球菌($．agalactiae)不仅能引起动物乳房炎，还能引起人的多种感染。对这些感染过 去人们一直采用抗生素治疗，但由于抗生素具有许多副作用，并不断导致无乳链球菌耐药菌株产 生，使抗生素治疗无乳链球菌感染受到了限制。因而促使人们寻求新的防制无乳链球菌感染方法。 研究证实，无乳链球菌Sip蛋白作为抗原免疫小鼠，能提供良好的免疫保护效果。但有关Sip蛋 白对无乳链球菌引起的动物乳房炎是否具有保护作用，尚不清楚。因此，本研究使用表达的Sip重 组蛋白制备抗原，免疫奶山羊后研究其对无乳链球菌性乳房炎的免疫保护作用，为进一步研究开 发无乳链球菌基因工程疫苗提供参考。 本研究从患乳房炎的奶牛乳汁中分离到l株链状球菌，并进行培养特性、生化特性、致病 性等鉴定和药敏试验。结果，该菌株在血琼脂培养基上长成淡灰白色、隆起、闪光的小菌落，呈 B溶血；在脑心浸出液(BHI)中培养，初期表现为均匀混浊，随着培养时间延长，在管底出现 沉淀；在6．5％NaCI的BHl中不生长；镜检为革兰氏阳性球菌，呈长链状排列：山梨醇、甘露 糖、七叶苷和棉实糖酵解试验阴性，乳糖、水杨苷和马尿酸钠酵解试验阳性：对试验所使用的青 霉素G、复方新诺明、红霉素等12种抗生素均不敏感；将该菌株经乳房人工感染泌乳奶山羊， 可引起乳房发生急性炎症，产奶量下降，Ch仃检测阳性甚至强阳性，乳汁SCC升高，乳汁成 分发生变化，同时伴有体温升高、心跳加快等全身症状。以上结果表明该菌株为致病性无乳链球 菌。 BL2I(DE3)，经 扩增获得癣，基因。将s扣基因插入到pET-32a(+)表达载体中，并转化到E．coli 提供的s／p基因序列相比，核苷酸和氨基酸同源性均为98％。说明s／p基因高度保守。进一步对 证实，表达的融合蛋白为目的蛋白。 重组蛋白进行纯化，得到单一的目的蛋白。将纯化后的Sip重组蛋白浓缩，并用弗氏佐剂乳化 后，按3rag／羊的剂量皮下多点注射免疫5只奶山羊，并以等量生理盐水免疫3只奶山羊作对照。 间隔两周再加强免疫1次。二免后两周，每只奶山羊一侧乳头管内注射无乳链球菌2x106CFU， 观察7天。结果，未免疫组奶山羊全部发病，乳房出现红、肿、热、痛、触之坚实等症状，乳 汁由乳白色转变为黄绿色，并出现浆液性液体，内含少量凝乳块；CMT检测为强阳性；乳汁SCC 升高，最高达630．7士72．5万／mL；乳汁成分改变；乳汁细菌学检查在接菌侧乳汁中均检出原接种 细菌。而免疫组奶山羊均未见发病，两侧乳房均未出现上述变化，乳汁细菌学检查两侧乳房乳汁 中均未检出原接种细菌，免疫保护率为100％。上述结果表明，表达的Sip蛋白可以对无乳链球 菌性乳房炎提供良好的免疫保护。 关键词：无乳链球菌，Sip蛋白，乳房炎，免疫保护性，奶山羊 Abstract themaincmls∞of animalmastitisandhamaninfections． Streptococcusagalactiae强agalactiae)is strains Lotsofsideeffectsandantibiotic-resistaot haveoccurredforuniversalof S．agalactiae usage thetreatment infectionwith isconfinedand has antibiotics．So ofS．agaloctiae antibiotics prohibited．It been thatthesurface had demonstrated of immunoganicprotein(Sip)anti