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脐血内皮祖细胞糖基化修饰及其在缺血性动物模型的应用 中文摘要 脐血内皮祖细胞糖基化修饰及其在缺血性动物模型的应用 中文摘要 目的： 周围血管疾病是威胁人类健康的世界难题，长期组织血流灌注不足可引起缺血性 溃疡和坏疽，最终导致三分之一以上的病人截肢。自1997 年以来，循环内皮祖细胞 （endothelial progenitor cells, EPCs ）参与的血管生成被认为是出生后血管发生的重要 机制。基于这一认识，细胞基础的针对损伤血管的修复得到广泛的研究。EPCs 定向 归巢到缺血坏死组织的第一步是EPCs 在缺血部位的滚动粘附，这是由P-选择素 （P-selectin ）和E-选择素（E-selectin）与其共同的配体P-选择素糖蛋白配体（P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-1）的相互作用完成的。研究发现，大约25% 的脐血CD34+ 造血干细胞表面的PSGL-1 不能有效地与P-选择素以及E-选择素结合。由于EPCs 与 + CD34 造血干细胞来源于同一前体细胞-成血管细胞，因此，我们假设EPCs 具有同样 的不足，如果我们能够修正这一功能缺陷，将会促进EPCs 归巢至血管形成部位，从 而为增强干细胞的治疗效果提供了一种新的有效的治疗策略。 方法： 1. 通过密度梯度离心法从脐血中分离出单核细胞层（mononuclear cells, MNCs ）， + + 通过免疫磁珠方法分离纯化CD34 细胞，将纯化的CD34 细胞接种于含EGM-2 培养 基的人纤维连接蛋白（fibronectin, FN ）包被的培养皿中进行培养及体外扩增。 2. 通过流式细胞术检测脐血EPCs 表面分子的表达，如CD133、CD31、CD34、 CD144、VEGFR2 、CD105、CD146、CD14 和CD45 。 3. 通过逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR ）分析脐血EPCs 特异基因的表达。 4. 通过免疫荧光技术分析血管性血友病因子（von Willebrand factor, vWF ）、 CD31、CD144 在细胞中的表达。 5. 分析所培养细胞对乙酰化低密度脂蛋白（Acetylated LDL, Ac-LDL ）的摄取能 力及体外成血管能力。 I 中文摘要 脐血内皮祖细胞糖基化修饰及其在缺血性动物模型的应用 6. 将岩藻糖基转移酶VI （ 1, 3-fucosyltransferase VI, FucT VI ）质粒转染至EPCs 中，并通过Western blot 方法对岩藻糖基转移酶蛋白的表达进行鉴定。 x 7. 使用特异性识别人唾液酸化的路易斯寡糖（sialyl Lewis X, sLe ）结构的抗体 HECA-452 ，通过流式细胞术分析转染FucT VI 表达质粒及转染空载体质粒的EPCs 表面sLex 的表达变化。 8. 流式细胞仪检测转染FucT VI 表达质粒及对照质粒的EPCs 与P-选择素和E- 选择素的结合能力变化。 9. 检测FucT VI 质粒转染组及空载体质粒转染组的EPCs 与经肿瘤坏死因子α （tumour necrosis factor-alpha, TNF-α ）处理的人脐静脉内皮细胞株（human umbilical vein endothelial cell, HUVEC ）的粘附能力。 10. 建立联合免疫缺陷小鼠下肢缺血模型，将体外标记的FucT VI 质粒转染组 EPCs 及空载体质粒转染组EPCs 通过尾静脉注射至小鼠体内，并检测其向缺血部位 的归巢。 11. 建立联合免疫缺陷小鼠下肢缺血模型，将试验小鼠随机分为3 组：生理盐水 组、EPCs 未经过糖化处理组、EPCs 糖基化处理组。将细