人新的精子结合蛋白基因TSBP的真核表达、纯化及功能的研究.pdf

·中文论著摘要· 人新的精子结合蛋白基因TSBP的真核表达、 纯化及功能研究 刖 罱 人睾丸精子结合蛋白基因(testis spellllbindingprotein，TSBP)是本实验室 在人睾丸组织中克隆的一个与牛精浆蛋白(bovineseminal proteins，BSP) plasma 相关的精子结合蛋白新基因，其编码的蛋白质与BSP蛋白在结构上有一定的相似 性，预测该蛋白是BSP蛋白功能相关的精予结合蛋白。BSP蛋白是牛精浆中的主 要蛋白质，其功能研究备受关注，研究表明，BSP蛋白在精子胞膜的脂类代谢、 调节精子获能及顶体反应等方面发挥重要作用。在猪和马的精浆中都发现了BSP 同源蛋白质的存在，这些同源蛋白具有与BSP蛋白相似的结合特性，说明BSP 蛋白及其同源蛋白在哺乳动物中是广泛存在的，而在人的精浆中其同源蛋白的发 现未见报道。 蛋白质酪氨酸磷酸化增加是精子获能的一个重要表现，在人精子中，蛋白质 酪氨酸磷酸化的增加是受eAMP／PKA信号途径调节的，因此精子获能极有可能与 PKA途径有关。BSP可以促进精子膜胆固醇的流失，精子膜组分的重排有利于 成，依次激活PKA，通过酪氨酸蛋白激酶和磷酸酪氨酸磷酸酶的双重调节而促进 蛋白质酪氨酸磷酸化，最终引起获能。为了研究TSBP与PKA活性之间的关系， 系，通过G418筛选出药物抗性克隆，建立了稳定的真核表达细胞系。用放射自 显影法检测了稳定转染细胞系中PKA的活性，结果表明TSBP蛋白对PKA具有 能。 在前期研究中我们已对该基因进行了原核表达，原核表达系统具有表达效率 高，操作方便等特点，但缺乏翻译后修饰，为了得到与人体内功能相近的重组蛋 白，进一步研究该蛋白对精子获能及顶体反应的影响，则需要应用基因克隆技术 获得该基因真核细胞表达的重组蛋白。基于建立的融合蛋白表达载体 金属亲和层析柱对目的蛋白进行了分离纯化，获得的重组蛋白用于下一步该基因 功能的研究。 精子在体内只有经过获能、顶体反应，才能穿入卵细胞与其融合，完成受精； 同时，精子膜的功能与精子获能、顶体反应及精卵融合密切相关。因此，检测精 子的顶体功能及精子膜功能的完整性可准确地反映精子功能，并预测精子的潜在 受精能力。牛精浆蛋白BSP所具有的U型结构特点，形成多聚体结构，可与精子 表面的磷脂结合，促进肝素和HDL诱发的牛附睾精子获能。BSP蛋白还可与不 同来源的胶原、纤维蛋白原、肝素、钙调蛋白、IGF、apo一等结合，还可以抑制精 子细胞膜上的胆固醇迁移。TSBP是与BSP蛋白相关的精子结合蛋白新基因，与 BSP蛋白在结构上有一定的相似性，为了进一步探讨TSBP在相关方面的生物学 功能，我们检测了重组的TSBP融合蛋白对精子各方面功能的影响，包括精子的 获能、膜功能、运动性能以及精子蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKc)的活 性等。 材料与方法 l、材料与试剂 由本室保存。大肠杆菌JMl09感受态细胞、 PCR扩增试剂盒、限制性内切酶BamHI及XhoI、质粒DNA快速抽提纯化 公司。无内毒素超纯质粒纯化试剂盒购自V．Gene公司。琼脂糖、pGEM—TEasy 2 序列测定由Takara公司完成。其他常用试剂均参照《分子克隆实验指南》配制。 产品，均为分析纯。 新鲜人精液标本由辽宁省计划生育科研院生殖医学重点实验室提供。Pereoll 俾士麦棕由SchmidH生产，上海化学试剂厂分装。四氯四碘荧光素B(玫瑰红) 购自Fluka公司。孕酮购白天津金耀氨基酸公司。 2、TSBP基因真核表达质粒的构建 到pGEM-T I双酶切，进行分离、纯化、连接，获得重组 Easy／tsbp同时用BamHI及Xho peDNA3．1／mye．His(一)B／tsbp质粒，对重组载体进行双向测序。 3、真核转染细胞系的建立 胞免疫荧光及Westernblot等方法检测未转染及各转染细胞系内TSBP蛋白的表 达情况。 4、金属亲和层析纯化融合蛋白