人原代晶状体上皮细胞中PEDF基因下调对波形蛋白和αB-晶状体蛋白含量影响.pdf

中山大学博士论文 人原代晶状体上皮细胞中PEDF基因下调对波形蛋白和QB-晶状体蛋白含量的影响 人原代晶状体上皮细胞中PEDF基因下调对波形蛋 白和ttB一晶状体蛋白含量的影响 专 业：眼科学 博士生：杨静 导 师：刘奕志教授 中文摘要 研究目的： 研究人原代晶状体上皮细胞中PEDF基因表达与波形蛋白和aB一晶状体蛋白 的关系。 材料和方法： 眼组织来源：人尸体眼球来源于中山眼科中心眼库。所有与尸体解剖相关性 的研究均己通过中山大学人文伦理委员会的许可。我们所有的研究均遵照政府 及相关公共组织的关于人类及动物实验伦理道德条款。 人晶状体原代上皮细胞的培养：晶状体上皮细胞贴敷于尸体眼的晶状体前囊 膜下。在解剖显微镜下，撕取晶状体的前囊膜，平铺于培养皿底部，上皮细胞 面向上。滴取一滴胎牛血清与上皮细胞面，保持细胞面的湿润。放于37℃0．5％ C02的培养箱孵育2小时，使前囊膜充分贴敷于培养皿的底部。用含20％胎牛 血清的DMEM培养液于培养箱中进行培养。 siRNA centersiRNA Construct Finder和siRNA 采用GenScript’sdesign Target 的分子生物学技术将这些寡核苷酸序列克隆到质粒载体SDl21l上。然后通过 Minikit 用于慢病毒的产生。在用慢病毒感染细胞48小时后，用RNeasyplus 中山大学博士论文 人原代晶状体上皮细胞中PEOF基因下调对波形蛋白和Q8-晶状体蛋白含量的影响 提取细胞中的总RNA。做三次重复的实时定量多聚酶链式反应(Real-timePCR)。 实验中我们采用家族管理基因GAPDH作为对照基因。用AACt得出不同组PEDF 基因RNA水平含量的差别。人原代晶状体上皮细胞PEDF基因RNA干扰48 小时后，WesternBlot方法检测其中波形蛋白以及aB．晶状体球蛋白表达水平的 变化。 结果： 人晶状体原代上皮细胞的培养： 带有晶状体上皮细胞的人晶状体前囊膜完整的贴敷于培养皿上，24小时观察 到健康的晶状体上皮细胞贴敷于前囊膜上，5天后晶状体上皮细胞溢出囊膜范 围，迁移到培养皿上。10天后，培养皿上上皮细胞达到70％-80％的融合，并且 呈现出正常的上皮源性细胞的形态特征。 慢病毒感染人原代晶状体上皮细胞：鉴于普通质粒转染技术在原代上皮细胞上 的成功率比较低，所以我们构建了慢病毒载体结构来表达shRNA，以达到对PEDF 基因下调的目的。同时我们在构建的shRNA结构中表达绿色荧光(GFP)片断， 以便于观察感染的效率。在荧光显微镜下，对感染48小时后的细胞照相，我们 发现每一组的感染率都在8096左右。 shRNA作用下PEDF基因被下调的效果鉴定 表达相应shRNA的慢病毒感染人晶状体原代上皮细胞48小时后，收集细胞， 提取RNA。用定量聚合酶链式反应(Real-timePCR)检测PEDF基因mRNA水平 的表达变化。最终发现，未经任何慢病毒感染的对照组，以及表达非特异性随 机序列shRNA(scramble group)的慢病毒组PEDF的mRNA在大致相同的表达 水平。其余的三种针对于PEDF基因进行特异性RNA干扰的慢病毒组，其PEDF 的RNA水平与对照组以及scramble组比较均有显著的下调(pO．01)。 PEDF基因被干扰后波形蛋白以及QB一晶状体球蛋白含量的变化 用WesternBlot的方法检测对PEDF基因进行RNA干扰48小时后波形蛋白以 及QB一晶状体球蛋白含量的变化。用GAPDH作为内参基因。与未经感染的对照 组比较，a n 中山大学博士论文 人原代晶状体上皮细胞中PEOF基因下调对波形蛋白和aB-晶状体蛋白含量的影响 shRNA一3试验组中降低~93％．这项试验结果显示在特