两种遗传性眼病致病基因定位与突变研究.pdf

·中文论著摘要· 两种遗传性眼病致病基因的定位与突变研究 目 的 先天性白内障为较常见的眼病之一，是儿童失明的主要原因。在先天性白内 障患者中，8％一2596是遗传性的。利用我国的遗传资源优势，发现新的白内障致病 基因并揭示其突变规律和特点，用于指导产前基因诊断和遗传咨询，将有效地预 防和杜绝白内障患儿出生，提高人口质量。对于遗传性白内障的研究已有悠久的 历史，随着遗传学和分子生物学的迅猛发展，目前遗传性白内障已有39个基因座 被确定，其中19个遗传性白内障致病基因已被发现。这19个致病基因分别是10 个晶状体蛋白基因(CRYAA、CRYAB、CRYBAl、CRYBA4、CRYBBl、 CRYBB2、CRYBB3、 CRYGC、 色质修饰蛋白基因CHMP4B。但由于先天性白内障种类多，表型又多有交叉，研 究较为困难。虽然已经确定了多个致病基因，仍然有很多致病基因尚未发现。本 研究收集了5个遗传性白内障家系，利用先进的分子遗传学技术及人类基因组计 划的成果，开展了白内障致病基因研究。 诺里病(Norrie disease,ND)是罕见的X连锁隐性遗传病，以视网膜出血、 剥离导致儿童失明为其主要特征。因没有很好的治疗办法，ND预后极差。ND致 1．3的NDP基因。迄今为止，在NDP基因相关视网膜 病基因为定位于染色体Xpl 病变(ND、X连锁隐性遗传的家族性渗出性玻璃体视网膜病变、Coats病和早熟 性视网膜病)中，至少已经发现NDP基因的80种突变。本研究收集了一个中国 人诺里病家系，对该家系进行了致病基因突变的鉴定。 材料和方法 收集5个遗传性白内障家系，根据家族史、临床症状及体征进行准确的临床 诊断，绘制系谱图。与患者及其家属签署知情同意书后，采集家系成员外周血 5．10ml，--70℃冻存备用。 使用常规酚氯仿法提取家系成员基因组DNA。在目前遗传性白内障已知的基 因座中，选择包括19个已知常染色体显性遗传性白内障致病基因的共15个位点 合成微卫星标记的引物。应用聚合酶链式反应(PCR)扩增各家系全部成员的基因 组微卫星片段，通过8％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离PCR等位片段，硝酸银染 的MLINK程序进行微卫星标记两点间连锁分析，计算两点连锁LOD值。根据个 体的等位基因型，家系成员间的亲缘关系及孟德尔遗传定律，人工构建家系成员 的单体型。 根据美国国立图书馆数据库中的标准序列，对染色体22q11．2．12．15区域内的 进行PCR引物设计，扩增这些基因的全部外显子及外显子／内含子交界区。PCR 产物纯化回收后，直接测序。对于家系4中发现的PTCHD2基因可能致病突变， PCR扩增家系成员及268个无关正常个体的该基因第20个外显子与部分内含子， I消化PCR产物，琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段；使用高保真 限制性内切酶Apal (p．Argl19His)，设计针对突变的错配引物，采用巢式PCR扩增家系成员及100名 无关正常对照个体的HSF4基因外显子3中含有突变点的DNA片段，限制性内 2 切酶NsbI消化PCR产物，8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切片段。 收集1个诺里病家系，根据家族史、临床体征及眼科B型超声波检查进行临 床诊断。采集家系成员外周血标本，常规酚氯仿法提取基因组DNA。设计并合成 3对PCR引物，通过PCR扩增患者及其母亲NDP基因的全部3个外显子与外显 子／内含子交界区，PCR产物直接测序。针对可能致病突变，通过PCR产物限制 性内切酶分析和PAGE分析验证对家系所有13名成员进行突变鉴定。确定致病突 变后，对家系中一名怀孕的突变携带者，采集其胎儿绒毛、提取胎儿DNA。在 NPD基因附近染色体区域选择2个微卫星标记，设计PCR引物扩增胎儿及其他 家系成员微卫星片段，通过8％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳及银染分析PCR等位片 段基因型。最终通过单体型分析及限制性内切酶分析确定胎儿是否携带致病基因， 进行产前基因诊断。 结 果 临床检查表明5个遗传性白内障家系的表型包括多形态性白内障，后极性白 内障及核性白内障。调查确定五个家系成员共计212人