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实验二 血红蛋白及其衍生物的吸收光谱及定量测定 一、目的要求 1、掌握722型分光光度计的使用。 2、了解血红蛋白及其衍生物的吸收光谱的测定。 3、掌握血红蛋白标准曲线的绘制。 二、实验原理 血红蛋白（Hb）与O2结合生成氧合血红蛋白（HbO2），与CO结合生成一氧化碳血红蛋白（HbCO），因其血红蛋白分子结构不同，当光线分别透过各种Hb溶液时，所吸收的光波也各异，可显出特有的吸收光谱。这些吸收光谱可作为它们定性和定量分析的基础，如HbO2在可见光波长400~600nm范围内有三个特征的吸收峰，其峰值分别在415、541和576nm处，当氧合血红蛋白转为一氧化碳血红蛋白（HbCO），此时光谱发生改变，在波长419、540和569nm处出现三个特征的吸收峰，其中在500~600nm范围内三个特征的吸收峰如下图。 本实验先制备Hb及其衍生物，然后在不同波长下测其光吸收度，以吸光度（A）（又称光密度）为纵坐标，波长为横坐标绘制成吸收光谱曲线，由此可以确定它们最大的吸收波长。 三、仪器和试剂 1．仪器：试管及试管架；吸量管；滴管和 量筒；722型分光光度计；CO发生器。2．试剂： （1） 浓H2SO4； （2）甲酸； （3）蒸馏水； （4）血红蛋白溶液。 722型分光光度计能在可见光谱区域内对样品物质作定量的分析。该仪器广泛应用于医药卫生、临床检验、生物化学、石油化工、环境保护、质量控制等部门，是生物化学实验室常用分析仪器之一 基本原理 操作方法 注意事项 四、实验步骤 1．样品的制备： 用草酸钾抗凝，取静脉血，边取边轻轻摇动，即制得全血。 （1）氧合血红蛋白（HbO2）液：加蒸馏水20ml， 取全血0.1ml（3滴）盛于小烧杯中，混匀，此即HbO2液，呈鲜红色。（2）碳氧血红蛋白（HbCO) 液：取上述HbO2液约5ml于试管中，通CO气体（浓硫酸与甲酸在CO发生器中反应发生）约10秒钟，HbO2即变成樱桃红色的HbCO溶液。 2．吸光度测定及吸光光谱曲线的绘制： （1）将如上制备的2种血红蛋白液分别盛于比色杯内，在722型分光光度计上以蒸馏水为空白调节吸光度零点和100%（每一次读数均应用空白管调节零点和100%）。 （2） 先从波长500~600nm分别测定HbO2，碳氧血红蛋白的吸光度（在相应峰值的10nm范围内每隔2nm记录一次吸光度读数，其余均每隔10nm记录一次吸光度读数）。 （3）然后以吸光度为纵坐标，波长为横坐标描点，并将各点连接成曲线，即为血红蛋白及其衍生物的吸收光谱，但由于使用仪器不同，绘制出的血红蛋白及其衍生物的吸收光谱必有一些差异，对722型分光光度计来说，峰值误差在±3nm~5nm波长内是允许的。 思考题 1、什么叫吸收光谱？测定血红蛋白及其衍生物的吸收光谱有何意义？ 2、Hb属于哪类蛋白质，它的吸收光谱的特征反映它的什么结构成分？ 3、什么叫吸光度、透光度、消光系数及分子消光系数？ * 1、722型分光光度计的使用 溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收 的效应，物质对光的吸收是具有选择性的，各种不 同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色 光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量 减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即 符合于比色原理---朗伯-比耳定律 朗伯比尔定律： A=εlc ε：摩尔吸光系数 c：溶液的浓度 l：液层的厚度 A：物质的吸光度 预热仪器 选定波长 调节T=100％ 固定灵敏度档 调节“0”点 测定 关机 该仪器应放在干燥房间内，使用温度为5℃~35℃。 远离强电场、磁场 每次做完实验时，应立即洗净比色皿 为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿 暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命 当仪器停止工作时，切断电源，电源开关同时 切断。并且用套子盖住仪器，做好使用登记 比色皿的使用方法 拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面， 不要碰比色皿的透光面，以免沾污 洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净 比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸蘸干，以保护透光面 *