将RNA通过RT成cDNA以后再做实时荧光定量 PCR的问题.docVIP

Q：做反转录PCR 时，提取的RNA 该怎么用DNAase 1 处理？DNAase Ⅰ处理的目的是去除基因组DNA，PCR后不会有基因组DNA污染，扩出的是没有n内含子的cDNA，从而降低做定量PCR的误差。我原先也想买DNAase处理我提取的RNA，但是听我们实验室的人说效果不好（我不知道具体不好的原因），而且增大RNA降解的机会，所以我就没有处理，直接RT了。接下去就打算跨内含子设计引物做后续的荧光定量PCR（现在还没有做，呵呵~）。我看见有人是这样处理的(不知到对你是否有用):把酶加到TE溶液中（用RNase-Free的水配），先配成10mg/ml的母液后煮沸15min，冷却后放冰箱-20度保存，用时稀释50倍，100倍看你自己了，然后就是混合RNA，37度处理三十分钟。你可以问试剂供应商要一张DNAase的试剂说明书，我想，如果是好的试剂，里面都有说明说的，而且说得比较清楚。现在已经提取出总RNA了，需要做逆转录成cDNA，然后再做荧光定量PCR来观察基因表达量的多少。在这个实验中逆转录时的引物可以直接用荧光定量PCR的引物吗？还是有什么特殊的要求呢？如果是两步法做的话，反转录通常用的是随机引物或者oligoT,这样当然是无法用于PCR步骤的，需要重新选定基因特异性引物。为了避免RNA中有DNA染色体污染的的问题，在反转录以前最后做DNase处理，或者在设计PCR引物时，让上下游引物处于不同的外显子上（跨越内含子） 做逆转录时的基因特异引物只要出的条带无杂带，特异性强，扩增产物长度在150-300bp之内就可以用于荧光定量PCR。 1.“随机引物”是什么意思，自己如何设计呢？2.“oligoT”是不是指一段TTTTTTT……TTTTTT的引物，如果是，要多长，几个T呢？3.逆转录出的cDNA要用于后续的实时荧光定量PCR，“随机引物”和“oligoT”各自的优缺点都是什么？4.“在反转录以前最后做DNase处理”，具体是怎么做的？说得详细一点，呵呵~5.让上下游引物处于不同的外显子上（跨越内含子），这样做的目的是什么？6.我看见园子里有人说要用“TE”调零和稀释RNA，但是我在用紫外分光光度计测定RNA浓度时，直接用DEPC处理过的水调零和稀释RNA的。我这样做可以吗？“TE”具体是指什么呢？如果你只检测一个指标，可以用特异性引物，这样就可以避免RT-PCR过程中不同基因转录效率不一致所造成的误差。但是如果你要检测几个样本，你可以用oligo dT或random hexamer，不需要自己买，RT-PCR试剂盒内有。前一段时间bio-rad工程师做Presentation时说：现在文献内做realtime PCR的用特异性引物、oligo dT和random hexamer各占30%，剩下10%用oligo dT+random hexamer。如果你的引物靠近5‘端，且mRNA超过3000bp，最好用random hexamer,否则都可以。DNase一般的RNA提取试剂盒内会有。转成cDNA后常规PCR检测RT是否成功，primer是否特异，退火温度然后用一个样本2-10倍倍比稀释做realtime PCR，测定每对引物的efficiency。然后检测样本，采用公式计算Ratio。现在paffle（可能拼错了）的公式比较流行。如上所言，随机引物和oligoT都是商品化的，可以倒产品目录上看到相关信息。oligo T只能对具有ployA的mRNA进行反转录，它和随机引物的应用在分子克隆上有论述。DNase处理是防止提取RNA的过程中基因组DNA污染造成PCR中假阳性而采取的手段，如果是用Qiaogen的试剂盒提取RNA，参照其说明书进行；如果是用TRIZOL提前，在正常提取完成后，将溶解好的RNA样品按照DNase的说明书进行操作。跨越内含子的设计目的同上，如果引物设计在同一个外显子上，有cDNA和污染的基因组为模版获得的PCR产物无法区分，如果引物设计在不同外显子上，以cDNA为模版扩增的目的产物比较小（因为mRNA上内含子被切除了），且扩增效率较高，而以污染的基因组DNA为模版的PCR获得的产物要大一些（因为包括内含子序列），扩增效率会低，甚至扩增不出来。据说TE在紫外上信号相对稳定，其配方见分子克隆。 我是按照两步法做逆转率荧光定量PCR。现在已经买到RT试剂盒了，马上要开始做逆转录这一步。试剂盒的东西还是很全的，里面有三种引物：oligo T，随机引物，对照引物。我的样本RNA是用Trizol提的，是不是在逆转录以前必须要用DNA酶处理所提的RNA？我听有人说，可能是DNA酶本身的因素，用DNA酶处理RNA也会引起RNA降解的危险。如果我用Trizol提出RNA，不做DNA酶处