蛋白质消化操作流程.docVIP

有还原烷基化蛋白质消化操作流程 将所选择的胶点用1.5mm切胶笔切下，置于eppendorf (EP) 管或96孔PCR板中,并记录点号及相应的位置； 加50μL DD.H2O 洗两次，10min/次； 加50 mM NH4HCO3/乙腈=1：1溶液50μL，超声脱色5min或37℃脱色20min，吸干； 重复步骤3，直至蓝色褪去； 加乙腈50μL脱水至胶粒完全变白，真空抽干5min； 加10 mM DTT（10μL 1M DTT，990μL 25mM NH4HCO3配制） 20μL，56℃水浴1hr； 冷却到室温后，吸干，快速加55 mM IAM （55μL 1M IAM，945μL 25mM NH4HCO3配制）20μL，置于暗室45min； 依次用25 mM NH4HCO3、50％乙腈溶液和乙腈洗，乙腈脱水到胶粒完全变白为止，真空抽干5min； 将0.1μg/μL的酶储液以25 mM NH4HCO3稀释10倍，每EP管加2μL，稍微离心一下，让酶液充分与胶粒接触，4℃或冰上放置30min，待溶液被胶块完全吸收，加25mM NH4HCO3 10-15μL置37℃，消化过夜； 加入2%TFA终止反应，使TFA终浓度为0.1％，振荡混匀，离心。 说明: 1.每加一次溶液都要漩涡振荡，胶粒要完全浸没在溶液中，进行下一步操作前要把溶液吸走。 2．如果胶粒超过1.5mm3,把胶粒分