一种快速测定发酵液中ε聚赖氨酸的方法.pdfVIP

中国科技论文在线 一种快速测定发酵液中ε-聚赖氨酸的方法 程传荣，田丰伟，张灏，陈卫 江南大学食品学院食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡（214122 ） E-mail ：fwtian@ 摘 要：为了建立一种快速方便的 ε-聚赖氨酸检测方法，本研究基于 ε-聚赖氨酸与 Dragendorff’s 试剂的沉淀复合物可与硫脲产生显色反应，提出了一种利用分光光度计快速 检测 ε-聚赖氨酸的新方法。ε-聚赖氨酸含量与反应复合物吸光度在pH2.0 ～5.0 ，反应时间 在45min 以内，具有较高的线性相关性。分光光度计测定波长为435nm。ε-聚赖氨酸工作 曲线相关系数R2=0.9999 ，线性范围为0.10g/L ～2.50g/L ，RSD=2.28% ，检出限为0.01g/L。 回收率为96.50% ～100.53%。该方法相比于Itzhaki 法具有较高的准确性。最后以该方法为 依据建立了一种利用96 孔板高通量快速检测ε-聚赖氨酸的方法。 关键词：ε-聚赖氨酸；Dragendorff’s 沉淀；分光光度法；96 孔板 1. 引言 ε-聚赖氨酸（ε-PL ）是白色链霉菌产生的代谢产物，抑菌效率高，热稳定性好，是一 种高效、无毒、安全、无副作用的食品防腐剂，具有良好的应用前景[1] 。对发酵液中 ε-聚 赖氨酸的定量检测是 ε-聚赖氨酸产生菌选育及发酵调件优化的重要内容之一。目前 ε-聚赖 氨酸检测的常用方法为 Itzhaki 法，此方法影响因素较多，大批量样品分析较慢。根据 ε- 聚赖氨酸与 Dragendorff’s 试剂中铋的沉淀反应是 1：1，用硫脲定量沉淀中铋的原理，本文 中使用分光光度法和酶标仪快速测定发酵液中的ε-聚赖氨酸，为 ε-聚赖氨酸的进一步研究 和开发提供了检测依据。 2. 材料与方法 2.1 仪器 紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；酶标仪，美国 Thermo 公司；其 他均为实验室常用仪器。 2.2 试剂 ε-聚赖氨酸对照品，产自日本窒素公司；五水硝酸铋，硫脲，Na S 等均为国产分析纯。 2 2.3 实验方法 2.3.1 溶液的配制 Dragendoff’s 显色剂（DR 试剂）：溶液 1 与溶液 2 的混合液。溶液 1：0.8g 五水硝酸 铋溶于 40mL 去离子水中和 10mL 冰乙酸的混合液；溶液 2 ：8.0g 碘化钾溶于 20mL 去离子 水。 硝酸铋的标准储备溶液：10mg 五水硝酸铋溶于 5mL 浓硝酸，用去离子水稀释至 100mL。 3%的硫脲溶液：3g 硫脲溶于 100mL 去离子水中。 1%的Na S：1g Na S 溶于 100mL 去离子水中。 2 2 ε-聚赖氨酸标准溶液：用去离子水配制 0，0.2，0.4，0.8，1.5g/L 的浓度梯度。 - 1 - 中国科技论文在线 2.3.2 分光光度计方法 准确吸取含不同浓度 ε-聚赖氨酸样品 1.0mL，置于 5mL 离心管中，加入 1.0mL 的DR 试剂，摇匀，沉淀形成，7000r/min 离心 10min，2mL 乙醇洗涤沉淀，7000r/min 离心 10min， 弃去上清液，加入 2mL Na2S，产生黑色沉淀，7000r/min 离心 10min，向沉淀中加入2mL 浓硝酸，20min 后，待沉淀完全溶解，用去离子水稀释至 10mL，取出 1mL，加入 5mL 硫 脲溶液，以 20%硝酸溶液加入硫脲为空白，在 λ=435nm 处测定吸光值。 2.3.3 酶标仪测定方法 准确吸取 50uL 样品加入 50uL DR 试剂沉淀，3500r/min 离心 20 min ，弃上清，加入 200uL 乙醇洗涤沉淀，3500r/min 离心 20 min