酶底物法快检技术检测生活饮用水中大肠菌群.docVIP

酶底物法快检技术检测生活饮用水中大肠菌群 成都市疾病预防控制中心 610041 ? ? 关键词：酶底物法；大肠菌群；生活饮用水；快速检测 ? 主要内容： 1、实验原理 2、仪器设备与试剂耗材 3、实验步骤 4、讨论与分析 ? 实验原理 该革新的检测技术利用分别由大肠菌群β-半乳糖苷酶及大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶代谢的两种「营养剂─指示剂」：邻硝基苯-β-D-半乳派喃糖（ONPG）及甲基香豆基葡糖醛酸苷（MUG），作为Colilert试剂的主要碳源。 1、利用大肠菌群细菌能产生β2 半乳糖苷酶分解ONPG 使培养液呈黄色，检测大肠菌群 2、利用大肠埃希氏菌产生β2 葡萄糖醛酸酶分解MUG 使培养液在波长366nm 紫外光下产生蓝色荧光，检测大肠埃希氏菌 3、改变培养温度，可检测耐热大肠菌群 因为大多数非─大肠杆菌属菌类没有这些酶，所以无法在Colilert试剂里生长及干涉这些物质。而有这些酶的少数非─大肠杆菌属菌类会受到Colilert特殊配方的基质选择性的抑制作用（专利技术）。 ? 酶底物法技术特点 1、减少杂菌干扰 2、无培养基干扰（传统方法常会因清洁剂、盐、抗生素、毒素、温度造成抑制反应） 3、结果准确，减少假阳性反应与假阴性反应 4、测试结果快速 ，18或24小时报告 5、判读容易 6、操作简便，使操作人员从繁杂的检测工作中解放出来 ? 仪器设备和试剂耗材 1、程控定量封口机Quanti-Tray Sealer Model 2X 美国IDEXX； 2、可充电紫外灯，6W，220V，366nm； 3、紫外线防护镜； 4、DST酶底物法24小时Colilert试剂 美国IDEXX； 5、51孔定量盘（无菌）；97孔定量盘（无菌） 6、阳性标准比色瓶，阳性51孔标准比色盘； 7、100mL含硫代硫酸钠无菌取样袋/瓶。 ? 实验方法 1、定性实验 大肠菌群、大肠埃希氏菌：取100mL水样加入酶底物试剂1支混匀，于36±1℃培养24h，观察结果。 耐热大肠菌群：实验同上，但培养温度变为44.5±0.5℃ 结果判定： 可见光下水样变为黄色，报告检出大肠菌群/耐热大肠菌群；紫外灯下水样有蓝色荧光，报告检出大肠埃希氏菌。否则报告未检出。 ? 2、定量实验 ? 51孔定量盘法，97孔定量盘法 大肠菌群、大肠埃希氏菌：取100mL水样加入酶底物试剂1支混匀，转入51孔定量盘内（或97孔定量盘），封口后于36±1℃培养24h，观察结果。 耐热大肠菌群：实验同上，但培养温度变为44.5±0.5℃ 结果判定： 可见光下计数51孔定量盘内黄色孔数，紫外灯下计数有蓝色荧光孔数，再查表《51孔定量盘法不同阳性结果的最可能数MPN及95%可信范围》或《97孔定量盘法不同阳性结果的最可能数MPN及95%可信范围》得出数值，结果以MPN/100mL报告。 ? 讨论与分析 1、酶底物法与多管发酵法的比较 多管发酵法和酶底物法均用于生活饮用水中大肠菌群的定量测定，但两法比较有如下特点：①方法接种量不同。多管发酵法水样接种55.5mL，酶底物法水样接种100mL。②方法量程不同。多管发酵法检测范围是2-1600（MPN/100mL），酶底物法检测范围是1.0-200.5（MPN/100mL）。③方法灵敏度不同。多管发酵法为每100mL样本中2cfu；酶底物法为每100mL样本中1cfu。④方法步骤不同。多管发酵法为多步骤测定，费时费力；酶底物法为一步测定，省时省力。⑤方法耗时不同。多管发酵法对于阴性水样需24小时报告结果，对于阳性水样则需72小时报告结果；酶底物法无论阴性或阳性水样均可24小时报告结果。⑥方法费用不同。多管发酵法可使用半成品培养基或自配培养基，检测成本低廉，目前国内也开发有初发酵试验的成品培养基和一次性耗材，但由于阳性水样必须进行验证试验，从而限制了该商品试剂的应用推广；酶底物法使用商品试剂，且目前只有国外生产商供应，使得检测成本较高，该法在东部经济发达地区使用较广。 ? 2、酶底物法应用的优势与不足 目前我国对生活饮用水进行卫生学评价,检测的微生物指标主要有大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌，这类指标是粪便污染的指示菌。经典的传统方法为多管发酵法，其检测周期较长，需2～5天，阳性结果需验证试验,使得实验操作步骤较为繁琐,不能对生活饮用水的卫生学状况做出快速评价，特别是在抗震救灾特殊时期，如能实现微生物指标的实时监测，将极大地支持抗震救灾工作地顺利实施，有力保障广大灾区人民群众生活饮用水的供水安全。因此, 酶底物法作为一种快检方法，其快速简便的特点可以较好的弥补传统方法的不足。 酶底物法（enzyme substrate technique）的原理是：利用大肠菌群细菌能产生β2半乳糖苷酶（β2D2galactosid