高柠檬酸盐对固氮酶铁钼辅基重组活性的影响①.pdfVIP

f∞ 一fOb 第 35卷 第 1期 厦门大学学报 (自然科学版) Vo1．35 No 1 1996年 1月 JournalofXiamenUniversity (NaturalScience) Jan．1996 高柠檬酸盐对固氮酶铁钼辅基 重 组 活 性 的 影 响① 篙，_—龙—’—-—敏————南_-一警’。许。H__—·良——树—一喜曾河萋定L，良．、／肼’-r)rI ．． ，A’摘 要 用高柠檬酸铁、柠檬酸钠、ATP和NaM 分别处理FeMoco，然后与UW45组份 I蛋 。 自进行重组，结果发现，高柠檬铁和柠檬酸钠分别使FeMoco重组体的 CH 还原活性提 高67 和 钠作用 ，其重组体 的C!H 还原括性分别提 高 121 和 119％，而 N 还原括性分别提高 303 和 135~ 而 FeMoco，FeMoeo一高柠檬酸铁体系及 FeMoeo-ATP一高柠檬 酸铁体系与NaMoO．作用后 ， 重组体的CzH：还原括性分别 下降 5 ，12 及 21 ．FeMoco一高柠檬 酸铁体系在 14．6K下的EPR 谱 ，与单独FeMoco的略有不 同，而 FeMoeo—ATP一高柠檬酸铁体 系的EPR谱则与前者有明显的差 椭 关中键国词图书F分eM类oc号o，Q耄高柠檬馥，重一一组堑L黼哆臣J1戈7。}／、徊相Mo原子上，而这 Shah口从固氮酶铝铁蛋 白分离到具有 CH。还原活性的铁 钼辅基 (FeMoeo)，以后国内外 许多学者进行多方面的研究 ]．Hoover等 发现，FeMoco的体 内生物合成必须 nifv基因， 在 nfiV基因存在下产生一种低分子量的物质 (V 因子)．后来发现这种V 因子即为高柠檬酸， 因而认为高柠檬酸盐是固氮酶铁铝辅基的一个组份 ．Kim和Rees等Eto3报道了MoFe一蛋 白的 x射线晶体结构分析结果 ，在其提出的FeMoeo结构模型 (Kim—Rees模型)中的Mo原子上连 ‘ 结着一个高柠檬酸分子． 然而迄今为止．尚未有从纯化的FeMoco中得到含高柠檬酸的直接证据，有人认为这是 由 ． 于在FeMoco的提取和纯化过程 中丢失高柠檬酸的缘故 ．为了进一步了解固氮酶的结构与 功能，特别是天然 FeMoco与高柠檬酸的相关性 ．我们 以纯化的FeMoco为材料用高柠檬酸等 一 系列物质进行体外重组试验 ，探讨高柠檬酸与FeMoco的结构和功能的关系． 1 材料和方法 1．1 菌培及固氮酶组份的分离提纯 菌株为棕色固氮菌 (AzotobacterVinetandii)OP菌株和缺FeMoeo的变株 UW45．菌体用 0 乖文 1995—0】一。5收到 国家 自然科学基金资助项 目 第 1期 张风章等 ：高柠檬酸盐对固氮酶铁铝辅基重组 活性的影响 W 375型超声波处理机 (美国产)破碎，菌液经反复抽气充氩后于 55℃下处理 5min，冷却并 于35000g，4C下离心25min，获得粗酶液．后续的固氮酶组份蛋 白的分离及纯化按以前采用 的方法 ．整个分离纯化过程均在严格无氧条件下进行． 1．2 FeMoco的提取 FeMoco的提取方法基本按文献[123，但作如下修改：MoFe一蛋 白酸处理及碱 中和后 ，进行 I)MF处理时减少 DMF的用量；在NMF中改用加人饱和Na2HPO i严格控制 NMF的pH值 为 9，FeMoco提取后立 即于浓缩器中真空浓缩． 】_3 FeMoco重组活性的测定 CH 还原活性测定：于抽充好的反应瓶 (8mL)中加人 0．5mLUV~45组份 I蛋 白(约2．0 mg)及 5 FeMocoNMF溶液 (O．04mmol／L)，于 30C水浴 中振荡预培 1h，取 100 重组 液于另一含有常规反应系统 的反应瓶 中，再加人 UW45的组份 Ⅱ蛋白(Fe蛋 白)0．5mL(2．0 mg)，注人CH 0．5mL，于30℃水浴中振荡30min，加^7 TCA终止反应，用 103型气相层 析仪测定 CH 生成量． N 还原活性的测定：按测定C：H。还原的步骤，在加人UW45组份 Ⅱ蛋 白后抽气充 N：(1 个大气