去细胞化肝脏支架组织相容性及体外细胞共培养的实验的研究.pdfVIP

摘要 具有可降解性，良好的生物相容性。然而，相对于复杂的肝脏结构，以往所使 用的人工合成支架材料都显得过于简单，无法满足肝细胞高密度生长所需营养 供应的要求，更无法模拟肝脏组织复杂的细胞生长环境。因此，寻找最大限度 模拟体内肝细胞生长微环境的三维支架材料用于肝细胞培养，保证细胞的数量、 形态及功能的维持，是解决组织工程化肝脏构建的首要问题。 去细胞化支架的出现，从根本上打破了传统支架材料结构简单的局限。去细 胞化支架是指通过化学或物理的方法将细胞破坏并从组织中完全移除，完好地 保留了细胞外基质(ECM)及组织器官的三维支架结构，早已成为组织工程研 究中的热点。去细胞化肝脏生物支架与以往的支架材料相比有着明显的优势。 首先，它保留的三维网状结构为肝细胞生长提供了所需的微环境。去细胞化肝 脏支架保留了肝脏的大部分细胞外基质包括胶原，弹性纤维，蛋白聚糖等组分。 这些成分不仅对于肝细胞的粘附、生长等生物学行为过程中起到重要作用，而 且能够与周围的细胞发生交互作用，为细胞的分化、迁移及细胞之间相互作用 提供信号。第二，支架中保留的血管网络解决了肝细胞生长所必需的营养输入 与废物排出的难题，从而使肝细胞的组织化培养成为可能。另外，由于细胞外 基质成分在不同的物种之间具有高度保守性，所以去细胞化技术得到的细胞外 基质支架具有良好的生物相容性及低免疫原性。最后，细胞外基质中可能遗留 的生物活性成分具有促进细胞生长、增殖及分化的生物特性。至今，去细胞化 支架已成功地应用于心血管、输尿管、膀胱等组织器官的研究中。由于去细胞 化技术在肝脏组织工程中的应用起步较晚，再加上肝脏结构极其复杂，利用去 细胞化肝脏支架进行可移植组织工程化肝脏的重建还很长时间的探索。另一方 面，去细胞化肝脏支架所构建的组织工程化肝脏必须通过异体移植的形式发挥 作用。去细胞化肝脏支架移植到受体体内，组织相容性是考察支架能够移植的 检测标准之一。如细胞成分去除不彻底则可引发严重的免疫排斥反应，炎症反 应不仅可以导致组织细胞降解，同时也是组织钙化的又一个重要原因。然而， 既使去除了组织细胞表面的大部分高免疫源性物质如组织相容性(MHC)I和Ⅱ类 n 硕士学位论丈 蛋白，由于在去细胞化过程中可能残留了少量的细胞碎片和脂质成分，以及去细 胞过程中引发的支架结构的改变，因此仍然存在引发免疫排斥反应或导致支架 结构钙化的可能。至今，还未见关于去细胞化肝脏支架异体组织相容性的相关 报道。因此，积极探索利用去细胞肝脏支架构建具有肝脏功能的组织工程化肝 脏，同时进行去细胞化肝脏支架组织相容性研究都具有重要的意义。 本课题组在既往工作中已成功使用化学去垢剂方法制备去细胞化全肝脏支 架。在此基础上，本实验进一步优化去细胞化大鼠肝脏的制作流程，使去细胞 化效果更加稳定。紧接着，我们利用去细胞化肝脏支架保留的管道结构连接到 体外的循环装置上，并与肝脏肿瘤细胞系C3A细胞进行体外循环共培养。实验 证实细胞在流动的状态下与支架结构紧密地粘附，并能够在较长时间里保持一 定的功能与活性。实验结果说明；去细胞化肝脏支架保留的肝内管道结构为在 其上进行干细胞的高密度培养创造了条件，在去细胞化肝脏支架上种植肝细胞 并进行细胞循环灌注培养甚至肝脏再生是现实可行的。另外，通过去细胞化肝 脏支架组织异体皮下植入实验我们也可以看出：利用Trixton．100及SDS化学去 垢剂制备的去细胞化肝脏支架脱细胞化效果完全，去细胞化后的肝脏支架结构具 有良好的组织相容性及低免疫源性，这说明使用去细胞化肝脏支架作为支架材 料适合异体移植，为进一步构建可供移植的组织工程化肝脏的研究提供了理论 基础。 第一章去细胞化肝脏支架体外循环灌注培养实验 目的：利用去细胞全肝脏生物支架进行体外肝细胞循环灌注培养，并对所得到 生物支架进行功能测定及组织学观察，为进一步的体外肝脏组织重建奠定实验 基础。 方法：以SD大鼠作为研究对象，利用化学去垢剂方法制各全肝脏生物支架。首 先取SD大鼠肝脏，将所得肝脏经门静脉插管后依次灌注曲拉通 摘要 盐缓冲液(PBS)灌洗支架上残留SDS210h，将支架结构中的肝静脉、胆管及 肝动脉以1撑丝线结扎。去细胞化肝脏支架经过氧乙酸(0．1％)消毒后使用PBS 细胞化肝脏支架门静脉注入支架中。再利用去细胞化肝脏支架保留的