抗EGFR人源化抗体的构建、表达、纯化和功能分析.pdfVIP

factor growth 表皮生长因子受体(epidermal receptor，EGFR)是一种跨膜 的酪氨酸激酶受体，由N末端的胞外配体结合域，疏水性的跨膜仅螺旋结构域 (锚定受体于细胞膜上)和胞内的酪氨酸激酶结构域三部分组成，是HER受体 家族的一员。当EGFR与配体结合后，胞内酪氨酸激酶结构域就会发生交联磷 酸化作用，从而引起下游一系列信号传导通路的活化。EGFR不仅在人体的所 有表皮细胞和一些正常组织细胞中表达，且在人体许多实体瘤中出现过表达的 现象，受体的表达水平与肿瘤的分化程度、恶性程度、肿瘤的侵润及预后密切 相关。所以以EGFR为靶点治疗肿瘤已经成为肿瘤治疗的一个新的热点，市场 上也出现了以EGFR为靶点的小分子化学药物和大分子的单抗药物，如抗EGFR 的人鼠嵌合抗体Cetuximab。 本实验室以Cetuximab为模板，设计合成抗体轻链基因序列和重链可变区 基因序列，拼接成完整的轻重链基因并克隆到plRES双表达载体中，已成功构 建出7种表达载体C1-427，其中的C3(即3撑抗体)与抗原的结合能力较高。 本研究就是在此基础之上，重新把抗体的4种轻链基因和3种重链基因分别克 和PH3)。共转染轻链和重链的表达载体到293T细胞，重组得到12种抗体。 ELISA法检测抗体与抗原的结合能力，结果显示7群、10#和11撑抗体与抗原的亲 和力较高。重新将3撑、7撑、10#和11撑抗体的轻重链基因片段分别克隆到高表达 的pcDNA3．1载体上，然后共转染到CHO细胞中，G418抗性筛选稳定单细胞 克隆系。 Western blot和ELISA法检测抗体的表达和亲和力，结果显示除了 3存抗体的结合能力低之外，其它3种抗体与抗原的结合能力都较好。扩大7撑、 10#和ll群抗体的稳定细胞系的培养规模，收集细胞上清，用rProteinA亲和层 析纯化浓缩抗体，最终得到l 4．29x10{M和3．74x10一M，结果表明人源化抗体与阳性对照相比，与抗原的结 合能力处在同一水平上甚至要略好。细胞的划痕实验也表示7拌、10#、11撑对 抗EGFR人源化抗体的构建、表达、纯化和功能分析 肿瘤细胞的生长和迁移是有一定的抑制作用。动物实验初步显示这3种抗体都 有一定的抑瘤作用。 综上所述，本实验成功的构建表达了12种抗EGFR的人源化抗体，其中只 有3种抗体与抗原的亲和力较好。对这3种抗体初步进行了初步的分析，实验 结果表明人源化抗体对肿瘤细胞的生长和迁移具有一定的抑制作用。 关键词：EGFR、人源化抗体、亲和力、rProteinA纯化 Il Abstract Abstract factor atrans-membrane Epidermalgrowth receptor·(EGFR)is receptor kinasethatincludesthreedomains：an tyrosine N—terminalextracellular domain，a helix ligand-bindingsinglehydrophobic trans-membrane—anchoringalpha anda C-terminaldomainwith region cytosolic tyrosineenzymaticactivity．EGFR to HER of andalsocalled belongs familyreceptors ofEGFRtoits