人PTEN基因RNAi和RESC慢病毒载体的构建及其功能的相关性与研究.pdf

中文摘要 人PTEN基因RNAi和RESC慢病毒载体的构建 及其功能的相关性研究 博士生 王玉梅 导师 盛光耀教授 郑州大学第一附属医院儿科 河南郑州450052 中文摘要 andtensin 与张力蛋白同源的10号染色体缺失的磷酸酶基因(phosphatase deletedonchromosometen homologue gene，PrEN)是迄今发现的磷酸酶家族中 首个抑癌基因，PTEN蛋白具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶双重活性，其脂质磷酸 酶活性可以去掉3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)3位上的磷酸基团，使其转 化为4，5二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)，从而调控细胞的增殖与凋亡。其蛋白磷酸 酶活性可以抑制黏着斑激酶(FAK)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化， 调节细胞的黏附及迁移。研究发现多种实体瘤中存在有尸陋Ⅳ基因的突变、等位 leukemia，AL)中也存在有尸珏’Ⅳ基因不 基因的缺失或低表达，急性白血病(acute 同程度的缺失、低表达、甲基化。但是PTEN基因及其蛋白的异常如何在AL的 发生发展、血管新生及髓外浸润过程中发挥作用仍有待于进一步探讨。 儿童AL是一组起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病。它是由于不成熟的淋 巴系或髓系祖细胞在发育成熟过程中失去调控，从而呈克隆性扩张，使得细胞 被阻滞于一定的分化期而发生的。AL的发病机制目日i『多认为是环境因素、遗传 因素以及癌基因和抑癌基因等多种致病因素综合作用的结果。近年来由于分子 生物学技术的迅速发展，多种抑癌基因在AL发病中的作用越来越明确。PTEN 在AL发病机制中的作用越来月受到重视。 RNA干扰(RNA 达，是研究内源性基因功能和信号转导途径的强有力工具。但是在RNAi过程中 中文摘要 常有“脱靶效应”的发生，造成对试验结果的误判。为研究PTEN基因在儿童AL 发病机制中的作用，本实验构建了P删基因的RNAi及其逃避RNAi策略结构 (RNAinterference escapestrategy 用人T淋巴细胞(T 基因敲减(T．LC．shPTEN)$1 化情况、细胞增殖和细胞周期的变化。应用人主动脉内皮细胞永生化细胞 ．shPTEN)$1 损伤修复变化，并检测相关信号通路分子表达情况。本实验旨在探讨PTEN基因 的生物学特性，及其下游信号分子与儿童AL发生、发展的相关性。探讨所构建 过程中脱靶效应对实验结果造成误判的作用。 的构建与鉴定 实验目的： 构建人尸珏W基因RNAi及其RESC救援的慢病毒载体并进行鉴定，为能有效 的避免“脱靶效应”所引起的假阳性结果对实验的干扰、为研究户疆’Ⅳ基因功能提 供稳定的转染载体。 方法： 1．构建策略设计并合成1对己筛选确定的能表达P珏’Ⅳ基因RNAi的发夹式 orshort RNA结构(small hairpin 环(TTCAAGAGA)，每对寡核苷酸两端分别带有酶切位点以方便基因操作。 该有效靶序列的特点是：GC含量在35％55％，以碱基“G”开始，连续5个碱基“T” II 中文摘要 结束。oligo 在此基础上根据密码子简并性引入RESC机制：在尸死Ⅳ基因shRNA对应的位置引 入4个同义点突变，在核苷酸水平上改变基因，而其所表达的PTEN天然蛋白编 码不变，又使shRNA不能作用于这种“外源设计的mRNA”，从而允许救援。“外 源设计的mRNA”两端分别带有酶切位点以方便基因操作。把这个基因片段与 的变