新型交联酶聚体技术及其在蛋白组学与生物催化中应用.pdf

． 中文摘要 本文针对交联酶聚体(Cross-linked enzyme 用上的两类缺陷，即制备过程中沉淀步骤酶活损失大，催化大分子底物反应时传 质限制严重，分别提出了糖类添加剂改善CLEAs酶活及多孔化CLEAs改性两种 制备新方法，并将其应用于分析化学与生物催化领域的三个体系，即蛋白组学分 析中的胰蛋白酶酶解过程、青霉素酰化酶酶法合成阿莫西林、木瓜蛋白酶酶法降 解壳聚糖制活性低聚糖，具体结果如下： 1．采用90％浓度乙醇为沉淀剂，0．075％戊二醛为交联剂，以传统方法制备得到 最适催化pH(9．0)、热稳定性和储存稳定性，均较游离酶有所提高；CLEAs“脚 手架状微观形貌决定了其优良的稳定性和高催化活性。 2．将胰蛋白酶CLEAs用于蛋白组学的酶解肽谱分析中，有效防止了高酶浓度 下胰蛋白酶的自水解；同时结合高温辅助酶解、超声辅助酶解可实现高通量肽谱 解析，分别缩短酶解时间至60min和60s，显著提高了分析通量和序列覆盖度。 3．针对传统青霉素酰化酶CLEAs制备过程中沉淀步骤酶活损失大的缺陷，设 计了在有机沉淀步骤加入糖类添加剂以提高最终CLEAs酶活的新技术，得到酶 活收率为79．3％的青霉素酰化酶CLEAs，比传统制备工艺酶活提高30％；揭示 了糖类添加剂(如海藻糖)以“水替代”方式与酶蛋白结合，起到维持酶蛋白天 然结构，保持CLEAs活性的作用机理。 4．将糖类添加剂改善的青霉素酰化酶CLEAs应用于抗生素阿莫西林的酶法合 成反应中，考察了CLEAs对阿莫西林合成收率和选择性的影响；引入30％甲醇 介质体系并在高底物比条件下反应，阿莫西林收率可达57％。 5．针对传统方式制备的木瓜蛋白酶CLE舡在催化大分子底物反应时效率低的 问题，提出以淀粉为致孔剂，在CLEAs内部形成孔隙结构，制成多孔化CLEAs 效果源于其多孔化的内部结构和更大的催化比表面积。 6．将多孔化木瓜蛋白酶CLEAs应用于酶法降解大分子底物壳聚糖制备生物活 性低聚糖反应，相同条件下还原糖释放量为游离酶催化时的85％，是传统CLEAs 的4倍；采用超滤膜分离技术得到了质量分数为67．5％、相对分子量为5～10kD 的具有优良抗菌性能的低聚壳聚糖产品。 关键词：交联酶聚体：胰蛋白酶；青霉素酰化酶；木瓜蛋白酶：蛋白组学： 阿莫西林；壳聚糖；糖类保护剂；多孔化 ABSTRACT‘ mordert0oVercometlle in ofcross-lin：ked problemspr印盯ation锄d叩Iplication l(iIldsof havebeen in 即巧meaggregates(CLEAs)，觚oilnproVedstraltegy deVeloped 也isth船is．The CLEAs CLEAs conVentionallypr印ared of口ypsin，tllesug册assiSted of G havebe％ penicm．maCyl弱e蛐d也epo砌ls—CI，EAsQ-CLEAs)of papain intlle of of锄oxicillilland 印plied digestion processproteomics，8yntllesis of de目埘ation chitosanrespectively． 1． ConV髓石onal w汕90％etll锄oI觞 CLEA占of奶，psin