血管紧张素Ⅱ对豚鼠心室肌Na，K-ATPase的调控.pdf

中文摘要 血管紧张素lI对豚鼠心室肌 Na，K—ATPase的调控 摘 要 Na．K．ATPase作为一种重要的膜蛋白几乎存在于所有的 真核细胞膜上，它主要有0【，p及丫亚基构成寡聚体，其 中仅亚基是催化亚基，影响Na．K—ATPase的主要功能，迄今 在心肌细胞上有广泛分布，它在维持正常静息电位和调节心 脏兴奋性方面发挥着重要作用。血管紧张素II(AngII)对其 它组织诸如血管平滑肌细胞、甲状腺细胞、乳房癌细胞中的 Na．K—ATPase活性以及亚基与信号传导途径的调节前人已做 了一些研究，如Douglas等发现血管紧张素II在大鼠近端小管 短时作用(2分钟)能够增加钠泵的活性，并且改变其磷酸 鼠甲状腺细胞PC．C13中，血管紧张素II对其1O分钟孵育作用 能够通过ATl受体及非典型的PKC．z活化上调钠泵的活性 性呈现剂量关系性抑制作用，且这一作用是通过AT。受体实 的问题，我们在急性分离的豚鼠心室肌细胞上探讨了血管紧 张素II短时程及长时程孵育对Na．K—ATPase活性的调控作用， 中文摘要 同时用mRNA和蛋白水平的Na．K—ATPaseGcl、仅2亚基表达的 变化来解释产生这种活性变化的分子基础。 目的：在急性分离的正常豚鼠心室肌细胞上，研究血管 紧张素11分别进行短时程(10分钟)及长时程(24小时) 孵育作用后，Na，K．ATPase活性的变化以及这些变化的亚基 基础。 方法：急性分离豚鼠心室肌细胞：体重在300一500g(1 心脏灌流，用II型胶原酶急性分离心室肌细胞。用10‘7M的 血管紧张素II对急性分离的心室肌细胞分别进行10分钟和 24小时孵育作用后，测定Na，K．ATPase活性的变化及其O【1、 0【2亚基表达的变化。 采用Muscella的双酶分析法【l】测定豚鼠心室肌 NADH吸光值消减率。用NADH吸光值消减率在有无10。M 的哇巴因存在两种条件下的差值来衡量Na，K．ATPase活性， 以“m01NADH／mgproteiⅣh作为Na，K．ATPase活性单位。 采用ImPCR方法测定全细胞的Na，K．ATPase0【1及0【2 亚基mRNA含量的变化：提取豚鼠心肌总I埘A，设计两种 DNA聚合酶对两种仅亚基的 引物反转录合成cDNA，用Taq 引物和GAPDH引物进行同管PCR扩增。扩增片段经2％琼 脂糖凝胶电泳鉴定，将长度相符的条带在紫外灯下切下并纯 化回收，随后将回收的DNA片段测序，确认扩增产物的正 确性。 0【1及0【2 采用westem的方法测定全细胞的Na，K．ATPase 中文摘要 亚基蛋白含量的变化：提取心室肌细胞总蛋白，用BCA蛋 白定量法进行蛋白质定量，10％SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳， 转膜，用5％脱脂奶粉25℃振荡封闭1小时，加0【亚基特异 性抗体，4℃孵育12小时，TBST沈膜四次，二抗稀释液37 ℃孵育1小时，DAB显色。 采用免疫荧光的方法测定Na，K．ATPasea1亚基在胞浆 与胞膜的分布变化：将急性分离的豚鼠心室肌细胞置于24 孔板中(铺有预先用多聚赖氨酸处理过的的圆形玻片)爬片， 约30分钟后给予药物作用，然后用4％多聚甲醛固定一小时， 加入0【1及O【2一抗四度过夜，然后加入荧光二抗显色，37℃ 避光放置30分钟后在激光共聚焦显微镜下观察结果，通过 扫描图片进行数据采集，以分析心室肌细胞Na，K．ATPase仅1 亚基蛋白在胞浆与胞膜间的转移。 结果：在急性分离的正常豚鼠心室肌细胞上，用10。7M 血管紧张素II进行短时程孵育，其可将Na，K．ATPase活性由 1 umol Pro／h升高 O分钟正常对照组的298．O土63．4NADH／mg umol 至给药组的711．1士54．9