在异种移植中TF对IBMIR的启动作用及人Treg对移植物保护作用和研究.pdfVIP

摘要 目的：临床上胰岛移植的应用给I型糖尿病患者带来了希望，同 时猪的器官在器官移植中的应用解决了捐赠器官严重短缺的问题。但 是，无论是同种还是异种胰岛经门静脉移植，都面临着移植后早期快 速的大量胰岛丢失的问题以及受体体内产生的免疫排斥反应最终导 致移植物排斥。因此本研究：①利用siRNA对新生猪胰岛细胞团的 TF目标基因进行特异性地表达沉默，分析TF对MCC与血液接触 后发生的IBMR的始动作用，探寻一种更为安全有效的措施来抑制 IL2ry乒小鼠作为猪胰岛移植受体，研究注射人外周血单个细胞和体外 扩增的nTregs后是否可以诱导以及如何诱导对胰岛移植物的免疫耐 受，建立一种以经体外扩增培养的Tregs为基础的治疗方法用以抑制 T细胞介导的异种移植排斥反应，从而减轻或消除免疫抑制治疗的需 求，为人nTregs在临床移植治疗的实际应用提供了参考。 方法和结果： 1．新生猪胰岛细胞组织因子基因沉默 本研究通过在新生猪胰腺原位及分离培养后的NICC免疫组织化 学检测均可见TF呈阳性染色，从而证实猪的胰岛细胞自身就有TF的 表达而不是因为细胞分离过程所导致的TF表达。本研究运用si砌峪在 基因水平上阻断猪胰岛细胞TF的表达，以抑制细胞与血液接触后触发 的IBMIR，从而减少猪胰岛的丢失。实验设计了5条siRNA，单独或 两两组合或三三组合按最佳转染条件分别转染MCC，结果发现其中 60％，矽O．01，且11F蛋白表达水平下降近50％。同时流式细胞仪检测 结果显示，siI州A转染后，MCC的活性未受明显的影响，排除了因细 胞死亡所导致MCC蛋白表达水平的降低。上述结果提示，设计的5条 达，以便于进一步研究TF在IBMIR发生中的作用。 2．新生猪胰岛细胞组织因子基因沉默体外抑制IBMIR 染TF si砌妊的MCC与人外周血在体外nlbing100ps模型内共孵育 60分钟后，观察血凝块的大小及重量，血细胞计数检测血细胞的消 耗，ELISA检测血浆中TAT及C3a的浓度，免疫组织化学检测中性 PCR检测各组MCC的仪．Gal 粒细胞浸润及IgG沉积情况，Real．time 基因表达。结果显示，转染TFsiRNA的MCC与人外周血共孵育后， 不仅其血凝块的形成较其他两组受到明显的抑制，血凝块的大小和体 积均有明显减小，而且血细胞计数显示血液中血小板、白细胞和中性 粒细胞的消耗显著减少，补体激活受到明显的抑制。结果还显示，TF 在MCC上的表达受到抑制后，血浆中n盯的浓度显著降低，中性粒 细胞的浸润明显减少。上述结果提示阻断TF在胰岛上的表达可以抑 制凝血、补体激活和前炎症介质的产生，也就抑制了IBMIR的发生。 同时免疫荧光染色结果显示，MCC的TF表达降低并不能明显减轻 PCR结果表明TF特 血凝块中IgG在MCC周围的沉积，Real．time 异性的siRNA对MCCTF基因的沉默作用没有影响到细胞仅．Gal基 因的表达，提示抗体介导的凝血激活通路并不是体外Loops模型中 IBMIR发生的主要启动因子。 3．人源化小鼠模型研究人调节性T细胞介导的异种胰岛移植耐受 自愿者外周血单个核细胞分离获得CD4+CD25+调节性T细胞，应用 reaction， Treg的抑制功能。混合淋巴细胞反应(mixedlymphocyte 池R)的结果显示，体外扩增的Tregs可以明显抑制针对猪异种抗原 的效应性T细胞的增殖效应；收集MLR各孔细胞培养上清并检测各种 细胞因子的浓度，结果发现体外扩增的Tregs可显著抑制效应性T细胞 分泌效应性细胞因子如IL．2和IFN．丫，而明显促进抑制性细胞因子 IL．10的分泌，但细胞培养上清中TGF．p的浓度没有明显的变化。上述 结果提示，经体外扩增体系扩增的Tregs具备调节性T细胞的表型和抑 制功能。本研究体内实验是将分离培养的MCC移植至NOD．SCID 射给接受Mcc移植的NoD．scID IL2矿小鼠体内。免疫组化用以检 测移植物的存活情况，流式细胞仪检测人细胞植入情况，FACS和 Real．time