桑查尔酮合成酶基因克隆表达及桑枝多酚类成分表征分析.pdfVIP

0IIIIII IIIIIIIIIIUlI II III 摘要 Y2519786 alba 桑枝为桑科植物桑MorusL．的干燥嫩枝，是我国应用历史悠久的中药。 桑枝微苦，平，归肝经，具有去风湿，利关节，行水气的功效。主治风寒湿痹， 四肢拘挛，脚气浮肿，肌体风痒等症。桑枝多酚类成分主要有绿原酸、芦丁、紫 云英苷等，不同种质资源的桑枝成分上大体一致，但是含量有一定差异。本研究 从黄酮类成分生物合成途径的分子机制入手，研究桑CHS基因的表达与多酚类成 分动态积累，其结果如下： 1．桑枝化学成分动态变化研究 a]ba 本研究选取了四川广泛栽种的桑MorusL．的两个栽培品种，即保坎61 号和红果2号，并且分别在每个居群选择了8棵样品树，从2010年1月到2010 年12月每月中旬采收当年生长的枝条(直径约lcm)，采用HPLC法建立两个栽 培品种1～12月的192批次样品的指纹图谱，进行了相似度评价及含量动态变化 分析。得出了桑枝化学成分动态积累的结果： 相同栽培品种、同一居群在相同采收对间下的的样本，其化学成分组成及含 量差异变化不大(相似度均大于0．9，各样品的总峰面积无显著差异)；而在不 同的采收时间的化学成分组成差异不大(相似度均大于0．9)，但含量差异较大， 最低总峰面积(6月)为最高总峰面积(1月)的5％。 两个栽培品种在相同采收时间下，样本的指纹图谱相似，其化学成分组成相 近(相似度均大于0．9)，但化学成分含量差异较大，如8月时保坎61号的芦丁 含量仅为红果2号的5296；两个栽培品种在不同采收时间的化学成分总含量变化 趋势总体一致，1～2月呈下降趋势，2~9月变化不明显，10～12月呈上升趋势。 2．CHS基因的克隆、相对表达与桑叶、桑枝化学成分含量变化相关性 本研究以样品桑MA—l、MA一2作为研究对象，于每月中旬进行采收，首次研 究了CHS基因在桑叶中的克隆、相对表达，及其与桑叶、桑枝化学成分含量变化 进行相关性分析。得到如下结果： 通过克隆CHS基因，经过测序并得到该基因片段，在Genbank进行同源性分 析，首次发现了CHS基因在桑叶中的存在，证明了CHS基因在桑叶中有表达。 通过多次实验条件的筛选，建立了提取桑叶RNA的最优提取方法为Trizol 5’一GTCCGA 法及克隆CHS基因的最优PCR条件：退火温度：56℃，上游引物P1 GACGAAGACGAG一3 5’一CTTGTACATCTCGGTGTA一37。 7、下游弓I物P2 通过实验条件的筛选及引物设计，建立了荧光定量PCR的方法与条件：退 火温度：56℃，上游引物Fl5’一AACATGTCGAGTGCGTGTGT一35’ 7、下游引物Rl 一GTCTTGAGCCCATCTTCAGC一3’。 首次对CHS基因在桑叶中的表达水平进行了研究分析，发现CHS基因在不同 生长发育期的桑叶中的相对表达量是有差异的。如MA一1树CHS基因最低相对表 量(10月)为最高相对表达量(9月)的5％。 CHS基因在桑叶中的相对表达量的变化趋势基本一致，从4月开始表达量逐 渐减少，5月降低，到6月又升高，7~8月逐步降低，然而9月达到最高值，此 时的表达量分别为1．29、1．47，随之降低。 CHS基因在桑叶中的相对表达量与桑叶中化学成分的含量的相关性分析得 出，二者呈正相关，相关系数的范围在0．457~0．862。这说明CHS基因在桑叶中 有效成分的合成起到一定的调控作用。从分子水平上为桑叶有效成分的研究奠定 了基础，也为分子机制方面研究中药品质提供了一定的依据。但是CHS基因在桑 叶中的相对表达量与桑枝中化学成分的含量的相关性分析得出二者无显著关联。 本研究揭示了遗传、产地环境等因素在中药品质形成过程中的影响，为今后 从分子水平上研究中药品质的形成提供了依据。同时，在未来的研究中，．应考虑 内因