嗜热菌蛋白酶降解家蚕血清蛋白的机理的研究.pdf

  摘要 嗜热菌蛋白酶（Thermolysin ）是一种由病原微生物分泌的金属蛋白酶，它需要一 个锌离子来维持其活性，四个钙离子来维持其结构的稳定性。嗜热菌蛋白酶属于金属 蛋白酶 M4 家族中的一种，在很多动物致病菌和真菌中发现了这一家族的酶。因为它 能够剪切寄主体内一些重要的蛋白而具有重要的毒力作用。对嗜热菌蛋白酶的研究到 目前为止都是用纯化的蛋白在体外和该酶作用来了解它的毒力作用。本文中，我们以 家蚕做为模式生物来研究它在一个复杂的生物背景中的作用方式。研究结果如下： 1．对家蚕幼虫注射嗜热菌蛋白酶会造成它们的死亡。对 V-1 的家蚕幼虫注射嗜 热菌蛋白酶或胰蛋白酶。注射嗜热菌蛋白酶后的家蚕，血液不停的流出，且发生黑化 现象，可能是因为破坏了它们的凝血系统。然而，注射胰蛋白酶后并不影响它们的凝 血系统而且家蚕也不会黑化。 2．嗜热菌蛋白酶可以剪切纯化的 rPPO1 使其丧失活性。用嗜热菌蛋白酶或胰蛋 白酶与纯化的rPPO1 反应，没有检测到发现明显的 rPO1 活性。用嗜热菌蛋白酶或胰 蛋白酶与微球菌诱导后的家蚕血清孵育结果显示，微球菌诱导后的家蚕血清没有酚氧 化酶活性，用胰蛋白酶处理后的血清也不能产生酚氧化酶活性。而用嗜热菌蛋白酶处 理后的家蚕血清可产生较高的酚氧化酶活性。这些数据表明，嗜热菌蛋白酶可以激活 血清中的原酚氧化酶，但是对纯化的 rPPO1 却没有作用。这表明，嗜热菌蛋白酶是 通过增加丝氨酸蛋白酶的活性来激活原酚氧化酶的。 3．嗜热菌蛋白酶不能直接激活丝氨酸蛋白酶。用胰蛋白酶处理 α-胰凝乳蛋白酶 原或 α-胰凝乳蛋白酶，有很高的 α-胰凝乳蛋白酶活性。然而，用嗜热菌蛋白酶处理 α- 胰凝乳蛋白酶原或 α-胰凝乳蛋白酶并不能使其转变成为有活性的 α-胰凝乳蛋白酶。 这表明嗜热菌蛋白酶不可以切割 α-胰凝乳蛋白酶原。用嗜热菌蛋白酶与 α-胰凝乳蛋 白酶原反应后，用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后考马斯亮蓝染色，显示α-胰凝 乳蛋白酶原仍保持活性状态。然而，用胰蛋白酶处理 α-胰凝乳蛋白酶原后，很大一部 分条带消失了。这更加说明嗜热菌蛋白酶不可以剪切 α-胰凝乳蛋白酶原。这表明嗜热 菌蛋白酶不可以直接激活丝氨酸蛋白酶。 4．嗜热菌蛋白酶对哺乳动物血清的降解作用。在 37°C 和 42°C 下，嗜热菌蛋白 酶可以降解哺乳动物血清如兔血清，人 AB 血清，胎牛血清和 BALB/C 鼠血清。在每 个时间点，嗜热菌蛋白酶的降解血清的作用在 42°C 时比在 37°C 时更加明显，而相 I     同酶活单位、相同剂量的胰蛋白酶对哺乳动物血清蛋白没有明显的作用。由此可见， 嗜热菌蛋白酶对血清蛋白的降解是一个普遍的现象。 5．对嗜热菌蛋白酶作用的拟建模型。通常情况下，在动物血清中有很多 serpin 蛋白能够调控不同蛋白的活性。血清中的 serpin 能够抑制像胰蛋白酶这类丝氨酸蛋白 酶的活性。然而，嗜热菌蛋白酶通过快速地、特异性的切割 serpin，间接激活血清中 的一些丝氨酸蛋白酶，加速对血清蛋白的降解。或者嗜热菌蛋白酶直接切割血清中的 其它蛋白酶使它们有活性。因此，加入嗜热菌蛋白酶后对 serpin 的切割或者激活其它 的蛋白酶是血清蛋白快速降解的原因。  关键词   嗜热菌蛋白酶，家蚕，血清蛋白，原多酚氧化酶，降解                      II     Abstract Thermolysin, a metallopeptidase secreted by p