盐法提取菠萝蛋白酶的研究.docVIP

盐法提取菠萝蛋白酶的研究 张桂香 王元秀 矫强 石玉宝 济南大学化学化工学院生物技术系 济南,250022 摘要： 论文采用正交实验，运用盐析法从菠萝皮中提取菠萝蛋白酶，对菠萝蛋白酶的提取工艺及其影响因素进行了研究，并对提取后得到的菠萝蛋白酶进行测定。 关键词：菠萝皮、菠萝蛋白酶、正交实验、盐析法 前言：酶的应用已有几千年的历史。特别是近30来，随着酶生产的不断发展，酶已广泛地用于食品、轻工、医药、环保以及科技等领域。 目前已经发现的酶约有3000种，但现在已应用的酶不足十分之一，而已工业化生产和应用的酶不过几十种[1]。 菠萝蛋白酶就是其中的一种酶，它存在于菠萝家族之中，它不仅存在于芽中，而且也存在于果实之中。通过压榨芽殖细胞，用丙酮、NaCl 或(NH4)2So4 使沉淀物凝固的办法可获取菠萝蛋白酶[2]。一般提取用的酶源是凤梨，但是价格较贵，约6000元/吨。而用菠萝皮，不但可以减少资源的浪费，降低费用， 又能减少环境的污染。 对于菠萝蛋白酶来说，使用盐析法提取是比较理想的一种方法，也使用的最广泛，其基本原理是：不同的蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度不同而能分离。此法简便、安全[3]。 1、材料与设备 1.1 材料与试剂 菠萝皮：市场采集；高岭土、酪蛋白：化学纯 pH试纸：山师化工厂；其它试剂均为分析纯 1.2 仪器与设备 电子恒温水浴锅：DZKW-C型，黄骅市卸甲综合电器厂 数显温控仪（电热恒温培养箱）：ZJYY-XMT-142，上海跃进医疗器械厂 离心机：LG10-2.4A型，北京医用离心机厂 高速组织捣碎机：Ds-1，上海标本模型厂制造 架盘药物天平：Hc-TP11-1型，上海第二天平仪器厂 722光栅分光光度计:上海第三分析仪器厂 2、实验方法 2.1 菠萝蛋白酶的提取方法 2.1.1 工艺流程[4-5] 菠萝皮洗净→去杂→捣碎过滤→[滤液滤渣→乙醇→浸提液→过滤→滤液]→加苯甲酸钠→压出液→10℃加白陶土→吸附物→加(NH4)SO4调pH6.5-7→ 洗脱液→正交实验方法→粗制品→溶解→NaOH调pH→待测液。 2.1.2流程说明 2.1.2.1滤液制备：选取干净的菠萝皮，除杂，在清水中漂洗三次，沥干，放入冰箱冷冻备用。用高速组织捣碎机打浆，过滤，取滤液，滤渣加入乙醇进行第二次浸提、过滤，合并两次滤液，按汁加0.05%苯甲酸钠作防腐剂，送入冰箱存放备用。 2.1.2.2吸附、洗脱：压出汁液置不锈钢保温缸中，不断搅拌，加入汁液量的 4%白陶土，在10℃吸附15-20分钟，静置过夜，次晨虹吸除去上清液，留下湿陶土，加入Na2CO3饱和液调节pH6.5-7，再加入按湿土计50%的(NH4)4So4，搅拌25-30分钟，进行洗脱。 2.1.2.3待测酶液制备:将上述洗脱液分别离心两次，取沉淀，溶解.按正交试验要求，加入食盐沉淀（盐析），5分钟后 ，离心，弃上清液，洗涤沉淀，过滤，定容。 2.2菠萝蛋白酶测定方法: C.D.U.方法[5] 2.3 菠萝蛋白酶盐析实验方法:利用L25(56)正交设计表[6] 表1 正交试验设计表 因素 水平 NaCl添加量 （%）（A） 溶液pH值 （B） 沉淀温度(℃) （C） 1 14 4 0 2 18 5 10 3 22 6 15 4 26 7 20 5 30 8 25 3、结果与讨论 3.1标准曲线测定结果 根据标准曲线测定方法，测定三次，取平均值,计算一元线性回归方程为A=0.0091x+0.03736,其中，A:吸光度，x：未消化酪蛋白的量。 3.2正交实验结果 从菠萝皮中按正交实验提取蛋白酶，并采用测定C.D.U方法分别进行测定，结果如表2。 由表2可以看出，影响酶提取的影响因素主次顺序为BAC，最优组合为A1B4C1,即：NaCl的量14%，溶液的pH值7，沉淀温度为0℃为最佳。 表2 正交实验结果 实验号 因素 酶含量 A B C 1 1 1 1 16.093 2 1 2 2 23.479 3 1 3 3 27.349 4 1 4 4 28.134 5 1 5 5 24.521 6 2 1 2 16.474 7 2 2 3 17.354 8 2 3 4 20.600 9 2 4 5 23.845 10 2 5 1 24.754 11 3 1 3 14.989 12 3 2 4 21.829 13 3 3 5 15.254 14 3 4 1 25.505 15 3 5 2 24.325 16 4 1 4 18.838 17 4 2 5 21.281 18 4 3 1 19.884 19 4 4 2 24.017 20 4 5 3 26.390 21 5 1 5 23.414 22 5 2