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盐法提取菠萝蛋白酶的研究
盐法提取菠萝蛋白酶的研究
张桂香 王元秀 矫强 石玉宝
济南大学化学化工学院生物技术系 济南,250022
摘要: 论文采用正交实验,运用盐析法从菠萝皮中提取菠萝蛋白酶,对菠萝蛋白酶的提取工艺及其影响因素进行了研究,并对提取后得到的菠萝蛋白酶进行测定。
关键词:菠萝皮、菠萝蛋白酶、正交实验、盐析法
前言:酶的应用已有几千年的历史。特别是近30来,随着酶生产的不断发展,酶已广泛地用于食品、轻工、医药、环保以及科技等领域。
目前已经发现的酶约有3000种,但现在已应用的酶不足十分之一,而已工业化生产和应用的酶不过几十种[1]。
菠萝蛋白酶就是其中的一种酶,它存在于菠萝家族之中,它不仅存在于芽中,而且也存在于果实之中。通过压榨芽殖细胞,用丙酮、NaCl 或(NH4)2So4 使沉淀物凝固的办法可获取菠萝蛋白酶[2]。一般提取用的酶源是凤梨,但是价格较贵,约6000元/吨。而用菠萝皮,不但可以减少资源的浪费,降低费用, 又能减少环境的污染。
对于菠萝蛋白酶来说,使用盐析法提取是比较理想的一种方法,也使用的最广泛,其基本原理是:不同的蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度不同而能分离。此法简便、安全[3]。
1、材料与设备
1.1 材料与试剂
菠萝皮:市场采集;高岭土、酪蛋白:化学纯
pH试纸:山师化工厂;其它试剂均为分析纯
1.2 仪器与设备
电子恒温水浴锅:DZKW-C型,黄骅市卸甲综合电器厂
数显温控仪(电热恒温培养箱):ZJYY-XMT-142,上海跃进医疗器械厂
离心机:LG10-2.4A型,北京医用离心机厂
高速组织捣碎机:Ds-1,上海标本模型厂制造
架盘药物天平:Hc-TP11-1型,上海第二天平仪器厂
722光栅分光光度计:上海第三分析仪器厂
2、实验方法
2.1 菠萝蛋白酶的提取方法
2.1.1 工艺流程[4-5]
菠萝皮洗净→去杂→捣碎过滤→[滤液滤渣→乙醇→浸提液→过滤→滤液]→加苯甲酸钠→压出液→10℃加白陶土→吸附物→加(NH4)SO4调pH6.5-7→ 洗脱液→正交实验方法→粗制品→溶解→NaOH调pH→待测液。
2.1.2流程说明
2.1.2.1滤液制备:选取干净的菠萝皮,除杂,在清水中漂洗三次,沥干,放入冰箱冷冻备用。用高速组织捣碎机打浆,过滤,取滤液,滤渣加入乙醇进行第二次浸提、过滤,合并两次滤液,按汁加0.05%苯甲酸钠作防腐剂,送入冰箱存放备用。
2.1.2.2吸附、洗脱:压出汁液置不锈钢保温缸中,不断搅拌,加入汁液量的 4%白陶土,在10℃吸附15-20分钟,静置过夜,次晨虹吸除去上清液,留下湿陶土,加入Na2CO3饱和液调节pH6.5-7,再加入按湿土计50%的(NH4)4So4,搅拌25-30分钟,进行洗脱。
2.1.2.3待测酶液制备:将上述洗脱液分别离心两次,取沉淀,溶解.按正交试验要求,加入食盐沉淀(盐析),5分钟后 ,离心,弃上清液,洗涤沉淀,过滤,定容。
2.2菠萝蛋白酶测定方法: C.D.U.方法[5]
2.3 菠萝蛋白酶盐析实验方法:利用L25(56)正交设计表[6]
表1 正交试验设计表
因素
水平 NaCl添加量
(%)(A) 溶液pH值
(B) 沉淀温度(℃)
(C) 1 14 4 0 2 18 5 10 3 22 6 15 4 26 7 20 5 30 8 25 3、结果与讨论
3.1标准曲线测定结果
根据标准曲线测定方法,测定三次,取平均值,计算一元线性回归方程为A=0.0091x+0.03736,其中,A:吸光度,x:未消化酪蛋白的量。
3.2正交实验结果
从菠萝皮中按正交实验提取蛋白酶,并采用测定C.D.U方法分别进行测定,结果如表2。
由表2可以看出,影响酶提取的影响因素主次顺序为BAC,最优组合为A1B4C1,即:NaCl的量14%,溶液的pH值7,沉淀温度为0℃为最佳。
表2 正交实验结果
实验号 因素 酶含量 A B C 1 1 1 1 16.093 2 1 2 2 23.479 3 1 3 3 27.349 4 1 4 4 28.134 5 1 5 5 24.521 6 2 1 2 16.474 7 2 2 3 17.354 8 2 3 4 20.600 9 2 4 5 23.845 10 2 5 1 24.754 11 3 1 3 14.989 12 3 2 4 21.829 13 3 3 5 15.254 14 3 4 1 25.505 15 3 5 2 24.325 16 4 1 4 18.838 17 4 2 5 21.281 18 4 3 1 19.884 19 4 4 2 24.017 20 4 5 3 26.390 21 5 1 5 23.414 22 5 2
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