NP突变体抑制流感病毒复制的机制及其形成流感病毒病毒样颗粒的关键蛋白.pdf

摘 要 流感病毒危害严重，不仅感染人和多种动物，而且可以引起人和动物发病死亡， 因而容易引发巨大的经济和社会问题。深入了解病毒的生物学特性及其蛋白间的相 互作用机理，研制广谱高效的抗流感药物及研发新型流感疫苗一直是流感病毒研究 中的热点问题。 在流感病毒的蛋白中，核衣壳蛋白是流感病毒的主要结构蛋白，在病毒复制周 期中发挥着重要的作用。由于 NP 蛋白非常保守，因此非常适合作为广谱抗流感药 物设计的靶标蛋白。 本文从可抑制野生NP 蛋白功能的NP 蛋白突变体（NPA387R ）入手，利用表 达荧光素酶流感病毒微复制系统，通过对 NPA387R 进行定点突变以及部分删除突 变，发现这些突变体在微复制系统中均丧失了转录活性，删除 NPA387R 上第一个 核定位信号不影响突变体抑制野生NP 的功能，但是同时删除NPA387R 上两个核定 位信号后突变体丧失了抑制野生NP 的功能。为了确定核定为信号是否决定突变体 对野生 NP 的抑制功能，我们在删除第一个核定位信号基础上，将第二个核定位信 号进行了突变，发现该突变体仍然可以抑制野生NP 的功能。 进一步我们建立了稳定表达NP 突变体（NPA387R ）的细胞系和稳定表达删除 第一个核定位信号和突变第二个核定位信号突变体的细胞系，通过免疫共聚焦实验 证明NP 突变体（NPA387R ）由于保留了核定位信号，主要定位于细胞核；而突变 核定位信号的NP 突变体主要分布在细胞质中。这两个细胞系均不再支持PR8 病毒 的生长，表明突变体NP 同样可以抑制流感病毒的复制。 突变体NP 是如何导致野生 NP 不能行使正常功能呢？为回答这一问题，我们 采用免疫共沉淀（Co-IP ）、蔗糖梯度密度离心和Western blot 等方法分析NP-NP 相 互作用，实验结果显示，野生NP 之间可以相互作用形成的复合体主要分布在蔗糖 梯度的下层，而NP 突变体与BSA 一样主要以低聚体形式存在，分布在蔗糖梯度的 上层。当突变体与野生NP 作用后在蔗糖中的分布发生了改变，野生NP 的分布向 蔗糖梯度的上层移动，而突变体NP 向蔗糖梯度的下层移动，表明突变体与野生NP 之间相互作用过程中，突变体NP 参与到野生NP 的多聚体中。结合突变体的细胞 定位，表明NP 与NP 的作用是在未进入细胞核之前就已经发生，通过相互作用， 突变体影响野生NP 形成正常的RNPs ，从而丧失聚合酶的转录活性。这一重要的发 现为研制抗流感药物提出了新的思路，即抑制 NP 功能的抗流感药物在细胞质中即 可发挥作用。 此外，采用同时表达多个基因的真核表达系统研究影响流感病毒病毒样颗粒包 装及释放的主要结构蛋白。实验中构建了同时表达HA 、NA 和M1 ，HA 和NA 以 及只表达 HA 的真核表达质粒，将这些表达质粒转染293T 细胞后，表达三个基因 4 以及表达两个基因的转染细胞上清均有血凝活性，最高效价达到2 ，而只表达HA 基因的细胞上清没有血凝活性。将这些上清超速离心，在透射电子显微镜下观察发 现表达三个基因和表达两个基因的样品中均有病毒样颗粒存在，而单独表达HA 的 样品没有发现病毒样颗粒。说明表达HA 、NA 蛋白就可以包装并释放病毒样颗粒， 而M1 蛋白对流感病毒病毒样颗粒的包装和释放并不起主要的作用。 本研究系统的阐述了NP 突变体抑制野生NP 功能及影响流感病毒复制的机理， 并且证实了流感病毒病毒样颗粒包装及释放的主要结构蛋白是 HA 和 NA ，为抗流 感药物的研制及流感病毒疫苗的研制奠定了基础。 关键词：流感病毒；NP 突变体；NP-NP 作用；多聚体；复制机制；病毒样颗粒 Mechanism for Inhibition of Influenza Virus Replication by NP VLP Abstract Influen