微生物法生产丙烯酰胺的研究(Ⅱ)——腈水合酶催化反应动力学与失活动力学.pdfVIP

18卷2期 生物工程学报 Vol18 No2 200口年3月 珊㈣如“rwf矿8面柚加蛔y Ma比h2()02 微生物法生产丙烯酰胺的研究(Ⅱ) ——腈水合酶催化反应动力学与失活动力学 陈 跖 孙旭东 史 悦 沈忠耀。 (清华大学化工系生物化工研究所，北京lo0084) 赵建勋孙小颖 (山东胜利石油管理局．东营257019) 擅要在以丙烯腈为原料，微生物转化生产丙烯酰胺的过程中，酶催化反应是过程的关键。为rr解酶催化的 动力学．本研究以自由细胞的酶为催化剂，进行了腈水台酶的反应动力学和失活动力学的研究。首先研究了菌体 浓度、温度、pH值、丙烯腈浓度、丙烯酰胺浓度等对腈水合酶倦化反应速度的影响。结果表明．庄这些因素中．温度 和丙烯酰胺浓度是最主要的影响因索。28℃时酶活为5659“-llL(菌液)，在5℃时的反应速牢仅为29℃时的 11．72％，相应的表观酶活为663“mL(菌液)。而在丙烯酰胺45％浓度条件下的酶活大约只有丙烯酰胺5％浓度下 的酶活的1，2。经过对不同温度下的反应速度的研究，得到腈水合酶水台反应的活化能为65．57kj·咖l～。本文进 一步研究了自由细胞状态下，菌体浓度、pH值、温度、丙烯腈浓度、丙烯酰胺浓度对腈水合酶失活的影响，得到了失 活动力学。结果表明，在这些因素中，对酶失活影响的最主要因素还是温度和丙烯酰胺浓度。尤其当丙烯酰胺浓 度到达35％时．酶活下降得很快，在55h后，酶活几乎为零。而在丙烯酰胺浓度为10％的情况下，55h的酶活仍然 还存在约50％。试验结果还表明，丙烯睛对酶的稳定性的影响很小。经过数据处理，得到的28℃的酶失活速率常 28kJ-mol1， 数为5℃下的21．77倍。经盘上对温度与失活速率常数的拟合，得到腈水合酶失活反应的活化能为92 关t词 丙烯酰胺，丙烯腈，腈水合酶．酶催化反应动力学，失活动力学 中圈分类号 删 文献标识码 A 文章编号lO吣306l{2002)02．0225．06 微生物法生产丙烯酰胺的研究起始于70年代 养过程中加入铁离子能有效增加酶括的产生，如第 中期，到目前为止，其使用菌种经过了几次变革。第 一代和第二代工业生产菌种鼢。加”。wsp．774和 一代菌种为硒odococcwsp．774，其活力达到363单＆u幽啪，郴c^厶’mr印船B23”’”J。对于含钴离子的 位，1985年开始在日本日东公司用于丙烯酰胺的生腈水台酶，钴离子的加入也能有效提高酶活，第三代 产；第二代菌种为风“由Ⅲm5c眦Mm觚B23，活力生产菌株鼢odD∞ccwrbd。c^rowJ1属于这种类 达到1260单位，在1988年替代了第一代菌株成为型…。 生产菌株；第三代菌种为Rht小。occ啉r‰^m峪Jl，在前人的研究中，发现第三代生产菌株的耐受 经优化，其活力达到2480单位，于1991年成为新一 性很强，高温、高底物浓度下酶活也能保持很长时 代的生产菌株“』。每一次菌种的更替、活力的提高， 间”“。在分析Jl的高耐受性时，认为主要是由于这 都带来工业生产产量的大幅度提高，日东公司的年 几种菌的腈水合酶的结构不同造成的。儿菌的腈 产量也由初始的4000u年提高到了20000t，年”l。 水合酶分子量为505kD，由lO个n亚基和10个口亚 本研究使用的菌种为一种诺卡氏菌，经培养条件的 基组成。而R312和B23分子量分别为100kD和85 u，mU“。 优化，最高活力已达到6567 kD，都由2个a亚基和2个B亚基组成。而且通过 从诱导型腈水合酶的分类来看，大体分为2