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TCF4/β-catenin 调控间充质干细胞向HGF 的趋化性迁移 中文摘要 中文摘要 组织损伤或神经系统疾病严重影响着人类的生命健康和生活质量，移植外源 性干细胞修复受损部位或重塑神经组织是目前治疗这些疾病的主要策略，但神经 干细胞（neural stem cells, NSCs ）或胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESCs ）由于 来源和伦理等问题不能被广泛应用于干细胞移植。间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs ）是一类多潜能成体干细胞，因其具有来源广泛、体外增殖快和 免疫原性弱等优势，迅速成为理想的组织工程种子细胞。体内外实验证实 MSCs 可以沿着趋化因子（HGF、VEGF 、SDF）浓度梯度的方向向损伤部位迁移，修复 受损的组织，但是关于细胞迁移的具体调控机制目前尚不清楚。Wnt/β-catenin 信 号通路不仅影响肿瘤的发生发展和转移，对干细胞的增殖、分化和迁移同样具有 重要的调控作用。研究发现许多细胞因子如HGF、VEGF 等可以激活Wnt/β-catenin 信号通路，影响细胞的分化和迁移，此过程中没有Wnt 蛋白的参与。本文旨在研 究肝细胞生长因子（HGF ）诱导MSCs 趋化性迁移过程中，Wnt/β-catenin 信号通 路的激活情况以及转录因子TCF4 在迁移过程中的作用，在此基础上进一步揭示与 迁移相关的Wnt 靶基因的转录变化。此外本文还探讨了Wnt/β-catenin 信号通路对 MSCs 细胞骨架重排的影响。 本研究首先采用Percoll 法从SD 大鼠的骨髓中成功分离和纯化MSCs ，并以此 细胞为实验材料，检测HGF 对MSCs 中Wnt/β-catenin 信号通路的影响。Western blot 结果显示HGF 能够增加MSCs 中β-catenin 蛋白的表达，具有剂量依赖性，50 ng/ml HGF 使β-catenin 的蛋白表达水平增加了2 倍。接着我们用50 ng/ml HGF 处理MSCs 不同的时间，发现HGF 处理30 min，MSCs 中β-catenin 表达开始增加，具有显著 性差异，一直到240 min MSCs 中β-catenin 仍处于较高的表达水平。免疫荧光染色 结果显示，50 ng/ml HGF 处理MSCs 30 min ，细胞质中β-catenin 开始累积，并具 有向细胞核转移的趋势；处理60 min，β-catenin 完全入核；在处理的240 min 内， β-catenin 没有明显出核或降解迹象。此外，通过TOPFlash/FOPFlash 双荧光素酶报 告基因检测HGF 处理MSCs 后细胞中TCF/LEF 转录活性的变化，与对照组相比， 50 ng/ml HGF 处理MSCs 60 min ，细胞中的TOPFlash 报告基因活性增加了4 倍， I 中文摘要 TCF4/β-catenin 调控间充质干细胞向HGF 的趋化性迁移 但FOPFlash 报告基因没有明显的变化。以上这些结果说明50 ng/ml HGF 能够激活 MSCs 中Wnt/β-catenin 信号通路。 本实验室前期工作发现，HGF 能够诱导MSCs 发生趋化性迁移，呈现剂量依 赖性，50 ng/ml HGF 使细胞的迁移总数达到最大值；为了检测激活的Wnt/β-catenin 信号通路是否参与MSCs 向HGF 的趋化性迁移过程，我们引入Wnt/β-catenin 信号 通路的抑制剂FH535 和激活剂LiCl，采用Boyden chamber 装置进行细胞群体性迁 移的实验研究。检测结果发现抑制剂FH535 明显抑制了MSCs 向HGF 的迁移，其 中5 μM FH535 使细胞的迁移总数下降了30%，20 μM FH535 使迁移总数的下降超 过了50% ；用LiCl 激活Wnt/β-catenin 信号通路则可以进一步促进MSCs 向HGF 的趋化性迁移。此外，我们利用Dunn chamber 装置检测了FH535 和LiCl 对单细 胞迁移轨迹的影响，结果显示，相比于对照组，FH535 降低了MSCs 向HGF 迁移 的速度和迁移效率；而LiCl 增加了细胞的迁移速度，对迁移效率没有明显影响。