茶氨酸合成相关基因RNAi载体构建的茶树遗传转化.pdf

摘要 茶氨酸为茶树特有的非蛋白质氨基酸，催化其合成的关键酶尚未研究清楚。 RNAi是双链RNA 的衍生复合物诱导同源基因mRNA 降解的转录后基因沉默技 术。在本实验室构建的茶树幼根cDNA文库中，获得GS1-1基因（contig47 ）的EST 序列，通过实时荧光定量PCR技术验证该基因可能与茶氨酸合成相关。利用GS1-1 基因的3 ’-UTR及其邻近区域构建RNAi载体进行茶树叶片遗传转化，以期进一 步解释茶氨酸生物合成机制。主要结论如下： 1、茶氨酸合成相关基因GS1-1的RNAi载体构建。在本实验室获得茶氨酸合 成相关基因GS1-1的EST序列的基础上，通过SMART RACE技术获得其3’-端全长 序列。选取3 ’-UTR及其邻近区一段长350 bp序列为干涉的目的片段，再从载体 pJawohl8上选取一段大小为500 bp 的内含子序列（茶基因组内无）为填充片段， 运用―零背景克隆‖技术构建出―发夹‖结构，通过验证该结构正确。将其重组到植 物表达载体pCAMBIA2301上，转化到农杆菌EHA105 中，成功构建出RNAi载体 pCAM-RNAi-GS 。 2 、龙井-43 叶片愈伤诱导最佳激素浓度及抗生素浓度筛选的研究。由于茶树 再生困难，选取龙井43 叶片作为遗传转化受体材料。叶片在1/4MS